外泌體miR-217通過下調E-cadherin對宮頸癌Siha細胞 淋巴管新生的影響

匡 婷，康佳文 ，郭思慧，李樂賽，張 勇

（1.湖南省腫瘤醫院/中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院，長沙 410013；2.湖南師范大學醫學院，長沙 410013）

根據2018年全球癌癥統計，宮頸癌是女性生殖道排名第一的惡性腫瘤［1］，淋巴結轉移陽性的患者預后差［2-4］。外泌體是細胞主動分泌的囊泡樣小體，能自由經過淋巴管運輸通道，可通過攜帶調節腫瘤轉移的miRNAs，促進腫瘤淋巴結轉移［5，6］。在本研究中，我們對宮頸癌淋巴結組織標本進行miRNAs的篩選及驗證，探索外泌體攜帶的miRNA-217影響宮頸癌淋巴轉移的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 組織標本收集與檢測患者簽署知情同意書，根據術后病理結果選取淋巴結組織標本，淋巴結陽性（LN+）患者3例，淋巴結陰性（LN-）患者3例。RTqPCR 檢測淋巴結組織中miR-217，miR-9-5p和miR-338-3p含量。

1.2 RT-qPCR 檢測miRNA 表達Trizol法提取淋巴結組織總RNA，反轉錄為cDNA，實時熒光定量PCR兩步法試劑盒進行檢測。反應條件：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，50 s，40個循環。以GAPDH作為參照，測定miR-217、miR-9-5p 和miR-338-3p基因水平，采用2-ΔΔCt法檢測各樣品基因的相對表達水平。引物交由上海生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 細胞培養、轉染及分組Siha細胞為本室保存，人淋巴內皮細胞（HLEC）購自德國海德爾堡PromoCell公司。細胞復蘇后用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養。用lenti-mCherry/miR-217轉染Siha細胞。細胞實驗分組為：空白組（Siha 細胞）、陰性對照組（Siha 細胞慢病毒空載組，LV-NC）、陽性實驗組（Siha細胞慢病毒miR-217 沉默組，LV-miR-217-siRNA）。收集各組細胞外泌體進行后續實驗。

1.4 細胞外泌體的提取及鑒定依據試劑盒（ExoQuick-TC）說明書提取宮頸癌Siha細胞分泌的外泌體，電鏡觀察形態，加蛋白裂解液提取蛋白，使用Hsc70，CD63 和CD81 抗體，進行流式細胞學蛋白檢測鑒定外泌體。

1.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力用胰酶消化收集轉染48h后的Siha細胞并計數，制成細胞密度為5×104單細胞懸浮液，三組不同細胞外泌體與細胞混和后，分別接種至Transwell小室中，置于細胞培養箱進行培養。48 h后，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫溶液染色，用棉簽擦掉小室的下層細胞，顯微鏡觀察并拍照，每組實驗重復3次。

1.6 Western blot檢測蛋白表達收集經三組不同細胞外泌體處理的人淋巴管內皮細胞（HLECs），提取三組細胞蛋白，加入蛋白上樣緩沖液（5×），變性后，SDSPAGE凝膠電泳，轉膜并封閉，一抗（E-cad 1：1000，GAPDH 1：5000）、二抗（1：10000），ECL試劑和顯影儀圖像采集。用Image J 軟件測定光密度值分析E-Cadherin等蛋白相對表達量。

1.7 小管形成能力檢測將分裝的Matrigel膠在冰上用培基以1：3比例稀釋后以200μL/孔平鋪于24孔板內，放置在37℃、5%CO2培養箱中30 min后備用；HLECs制成細胞懸液，取三組含不同外泌體的細胞與培基混和，以1×105細胞/孔將細胞鋪于膠表面，然后繼續于培箱中培養6h，取出24孔板于顯微鏡下觀察HLECs成管情況并計數、拍照。每組設置3個復孔。

1.8 統計學方法采用SPSS 16.0對數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組間采用獨立t檢驗，多組間采用多因素方差分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學尋找和預測E-Cad（CDH1）上游miRNAs通過檢索生物信息學網站TargetScan（www.targetscan.org）和miRcode（www.mircode.org），發現了miR-217，miR-9-5p 和miR-338-3p可能是E-cad的上游microRNA。結果見圖1。

圖1 軟件預測E-cad（CDH1）上游miRNA

2.2 RT-qPCR 檢測淋巴結組織中miR-217，miR-9-5p 和miR-338-3p 含量圖2可見，LN+組的miR-9-5p 表達為6.2±1.2、miR-217表達為5.7±0.8、miR-338-3p 表達為3.5±1.1分別明顯高于與LN-組的 2.1±0.7、1.5±0.8、1.7±0.8（P<0.05）。發現miR-217 表達差異最大（見圖2）。

圖2 淋巴結組織中miRNA 表達情況

2.3 外泌體miR-217對Siha細胞侵襲能力的影響通過Transwell小室法檢測各組細胞外泌體對Siha 細胞侵襲能力的影響。通過對穿過小室濾過膜的穿膜細胞進行拍照和計數，發現外泌體miR-217 表達下調的Siha 細胞侵襲能力較其他兩組明顯下降。空白組、陰性對照組及LV-miR-217-siRNA 組通過對小室濾過膜上的穿膜細胞細胞數量分別為328±43，369 ±62 和 139±16，LV-miR-217-siRNA 組的穿膜細胞數在三組中最少，差異有統計學意義（P<0.05），提示外泌體miR-217 表達下調的Siha 細胞侵襲力明顯減弱（見圖3）。

圖3 Transwell 實驗檢測各處理組細胞侵襲情況（結晶紫染色，×400 光學顯 微鏡）及統計

2.4 外泌體miR-217對淋巴管新生的誘導影響檢測三組細胞外泌體對人淋巴內皮細胞（HLECs）小管形成的影響。空白組、陰性對照組及LV-miR-217-siRNA 組細胞成管數量分別為43149 ± 401.3，44377 ± 284.4和 22144 ± 448.2。LV-miR-217-siRNA 組的細胞成管數量最少，差異具有統計學意義（P<0.05），提示外泌體miR-217 表達下調會顯著降低HLECs成管能力。結果見圖4。

圖4 檢測各組細胞外泌體對人淋巴內皮細胞（HLEC）小管形成的影響及統計

2.5 外泌體miR-217對淋巴內皮細胞中E-cad表達水平的影響WB檢測外泌體miR-217對人淋巴內皮細胞（HLECs）E-Cad表達的影響：三組細胞外泌體與HLECs共孵育48h，收集三組細胞并提取蛋白，WB檢測E-Cadherin表達。空白組、陰性對照組及LV-miR-217-siRNA 組E-Cadherin蛋白表達分別為0.5619±0.0033，0.561±0.0047和0.6078±0.0016。發現：LVmiR-217-siRNA 組E-Cadherin 表達明顯強于其它組，這提示外泌體miR-217 對淋巴內皮細胞E-Cadherin 蛋白表達是抑制的（見圖5）。

圖5 外泌體miR-217 對淋巴內皮細胞E-Cadherin 表達影響

3 討論

淋巴轉移是宮頸癌主要的轉移方式，但機制尚不明確。E-cad是上皮組織中細胞間粘附的關鍵介質，我們前期已證實E-cad在宮頸鱗癌組織中的表達低于正常宮頸組織［5］，宮頸癌細胞的粘附功能降低，侵襲力和遷移能力增加［7］。我們通過生物信息學檢索發現了miR-217，miR-9-5p 和miR-338-3p 可能是E-cad的上游miRNA，在陽性淋巴結中，miR-217，miR-9-5p 和miR-338-3p表達明顯高于淋巴結陰性組，且miR-217表達差異最大［8-10］。miR-217是否通過E-cad調節宮頸癌轉移無報道。

外泌體是細胞主動分泌的大小均一、直徑30～150nm 的囊泡樣小體，可攜帶包含miRNA在內的多種物質［11］，參與調節人體生理或病理過程。腫瘤來源的外泌體可以通過參與腫瘤轉移前微環境的形成，促進腫瘤發生轉移［12］。本研究發現，宮頸癌Siha細胞分泌的外泌體miR-217對癌細胞的侵襲能力有影響，外泌體miR-217-siRNA可降低Siha 細胞的侵襲能力，能促進Siha細胞侵襲轉移。實驗中發現LVmiR- 217-siRNA 組的細胞成管數量最少，證明外泌體miR-217表達下調會顯著降低HLECs成管能力。原發腫瘤周圍新生的淋巴管可將腫瘤細胞及其他生物分子快速輸送至區域淋巴結，最后造成淋巴結轉移。我們的研究提示宮頸癌Siha細胞外泌體攜帶的miR-217能促進淋巴內皮細胞的成管能力。Western blot檢測發現外泌體miR-217 抑制HLECs E-Cad蛋白表達。

綜上，我們的研究表明，癌源性外泌體miR-217能促進宮頸癌Siha細胞淋巴管新生，其機制可能是通過miR-217抑制人淋巴內皮細胞E-Cad蛋白的表達實現的。這對于揭示癌源性外泌體在宮頸癌淋巴轉移中的作用，了解宮頸癌的淋巴轉移機制有重要意義，也為干預和治療宮頸癌淋巴轉移提供了新思路。