杜氏肌營養(yǎng)不良癥基因治療新進展*

紀 偉，田國力，王燕敏

上海市兒童醫(yī)院，上海交通大學附屬兒童醫(yī)院 新生兒篩查中心，上海 200040

杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）和貝克肌營養(yǎng)不良（Becker muscular dystrophy，BMD），均由DMD 基因突變導致抗肌萎縮蛋白（dystrophin，Dys）缺失所致，是最常見的X 連鎖隱性遺傳性神經(jīng)肌肉病。DMD 在存活男嬰中的發(fā)病率為1／3000～5000[1]。在我國，每年大約有400～500 例DMD 患兒出生，總計DMD 患者高達7～8 萬人，是患病人數(shù)最高的國家之一?；颊咦畛跬ǔＴ?～3 歲時出現(xiàn)臨床癥狀，包括運動發(fā)育遲緩、步態(tài)異常、易跌倒等，肌肉組織的損傷導致患兒在8～12 歲時喪失行走能力并伴有多器官系統(tǒng)的受累，同時可出現(xiàn)認知、消化功能障礙以及心肌病等，大約在20 歲左右需要呼吸機輔助呼吸，20～30 歲時死于呼吸或循環(huán)衰竭[2]。BMD 是DMD 的輕度表現(xiàn)形式。

DMD 尚無有效治療手段，經(jīng)典的類固醇激素治療結(jié)合多學科的綜合評估和管理，可有效延長DMD 患者獨立行走時間，提高患者的生存質(zhì)量；但類固醇激素治療伴有肥胖、矮小、骨質(zhì)疏松等副作用，且不能改變疾病的最終結(jié)局。

隨著基因技術發(fā)展,基因替代、外顯子跳躍、基因組編輯、終止密碼子通讀等基因治療逐步成為研究熱點。而兩種基于基因治療的方法Ataluren 和Eteplirsen 已經(jīng)分別被歐洲藥物管理局（EMA）和美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準。但是，這些藥物只適用于一小部分患者，其他一些潛在的治療方法都處于臨床試驗的晚期。本篇綜述主要描述了基因治療中最重要和最有前景的進展，并對其治療優(yōu)勢及局限性進行分析。

1 基因替代治療

基因替代治療是在DMD 患者的基因組中插入外源的功能性DMD 基因，從而恢復DMD 患者骨骼肌、心肌細胞表達有功能的抗肌萎縮蛋白（如圖1）。腺相關病毒（AAV）具有肌細胞取向性[3]，可以作為DMD 基因載體。但AAV 非常小（4.5 kb），而DMD 基因是已知的人類最大基因（2.4 Mb）[4]，因而利用病毒載體導入截短的、能表達部分Dys 的DMD 基因是基因替代治療的一種選擇。有研究發(fā)現(xiàn)，在DMD 基因突變小鼠（mdx 小鼠）模型中，局部注射缺少70%編碼序列的微型Dys，可保護mdx 小鼠的四肢肌肉和心臟功能[5]。同樣，在金毛犬肌營養(yǎng)不良癥（golden retriever muscular dystrophy，GRMD）的犬模型中也實現(xiàn)了肌肉功能改善[3]。目前，針對AAV 介導的微型抗肌萎縮蛋白基因治療正開展多項臨床試驗，也有研究通過雙重腺相關病毒技術[6]和慢病毒載體[7]提高基因載體的容量，有望裝載全長的DMD 基因。

圖1 基因替代治療原理示意圖

系統(tǒng)地將AAV 輸送到骨骼肌、心肌進行基因治療，對部分患者是可行的，但仍存在挑戰(zhàn)。微型Dys 是否可改善肌肉功能尚仍不清楚。雖然微型Dys 在mdx 小鼠和GRMD 犬模型中實現(xiàn)了肌肉功能改善，但是mdx 小鼠肌肉質(zhì)量優(yōu)于人類DMD[8]，并且不同犬之間肌肉萎縮程度存在很大差異。因此，根據(jù)動物模型的數(shù)據(jù)很難預測微型Dys 在人體中的作用[9]。

轉(zhuǎn)基因表達的壽命有限。AAV 是一種游離體病毒，隨著時間的推移，肌肉更新導致轉(zhuǎn)基因逐漸喪失，從而使微型Dys 表達減少；但微型Dys 丟失將在基因?qū)攵嗑煤蟀l(fā)生仍不清楚。GRMD 模型的一項研究顯示，治療3 個月后，45%的肌肉纖維中存在微型Dys，56 個月后，僅有5%的肌纖維中存在微型Dys[10]。轉(zhuǎn)基因在體內(nèi)究竟能表達多長時間仍不可知。

基因替代治療不適用于體內(nèi)含有抗AAV 抗體的患者，這類患者約占所有DMD 的50%[11]，因?qū)Σ《疽職び忻庖叻磻?，可能對微型Dys 本身產(chǎn)生體液或細胞免疫反應[12]，故這類病人禁止接受AAV 基因療法。按照治療DMD 所需的病毒載體量，AAV 制造耗時且成本昂貴。使用小劑量治療一名患者所需的病毒載體的生產(chǎn)周期通常需要1～2 月，而僅美國每年就有大約400 名DMD 患者出生。這就要求藥企優(yōu)化生產(chǎn)工藝，以便在更短時間內(nèi)生產(chǎn)更多批量的病毒載體。

2 外顯子跳躍治療

外顯子跳躍治療是利用特異性反義寡核苷酸在DMD基因前信使RNA 剪接過程中，排除特定外顯子以重建閱讀框，將突變類型糾正為整碼突變，這樣大多數(shù)DMD 患者（見圖2）在理論上可以產(chǎn)生截短的、但功能正常的Dys，是DMD治療的又一策略[4]（見圖3）。約80%的DMD 突變可以通過跳躍1 到2 個特定的外顯子糾正突變類型來恢復閱讀框[13]，其中，51 號外顯子的跳躍可治療約13%的DMD 患者[14]。

圖2 DMD 突變示意圖

圖3 外顯子跳躍治療原理示意圖

Eteplirsen 是專門為51 號外顯子設計的一種反義寡核苷酸，2016 年9 月美國FDA 批準其用于DMD 治療，這是首個通過FDA 批準的DMD 基因治療藥物。I、Ⅱ期臨床試驗已經(jīng)證實了Eteplirsen 的安全性和耐受性，并在開放性非盲實驗中進行的Ⅲ期臨床試驗，多數(shù)患者步行能力明顯改善，對其進行肌肉活檢發(fā)現(xiàn)Dys 和抗肌萎縮蛋白糖蛋白復合物的表達恢復[15]。經(jīng)過3 年的持續(xù)治療和隨訪顯示，患者行走功能持續(xù)穩(wěn)定，沒有明顯治療相關副作用[16]，證實Eteplirsen 可以改善患者運動，延緩呼吸功能的下降[17]。

Drisapersen 也是一種能夠跳躍5l 號外顯子的反義寡核苷酸，在近300 名DMD 患者中進行的一項非盲試驗和三項安慰劑對照試驗[18，19]，結(jié)果顯示，Drisapersen 治療48 周后，治療組中年齡為6～8 歲患兒比安慰劑組6 分鐘步行距離（6MWT）有所延長[18]；但是在全年齡段的所有DMD 患兒中，治療組和安慰劑組的6MWT 無顯著性差異[19]。另外，Drisapersen 治療會有注射部位局部反應、一過性蛋白尿和發(fā)熱等不良反應。最終Drisapersen 未獲得FDA 和EMA 的批準。

同樣的，外顯子跳躍治療也具有其局限性，例如轉(zhuǎn)導不足、尤其是在心臟組織中，轉(zhuǎn)導效率低下，組織攝入不穩(wěn)定，需要頻繁用藥才能達到治療效果。為進一步提高外顯子跳躍治療效率，對提高反義寡核苷酸的傳遞或吸收的研究正在進行。目前，僅在動物模型中測試了與反義寡核苷酸結(jié)合的肌導肽，它們使骨骼肌和心肌的外顯子跳躍性水平提高了幾倍[20]。富含精氨酸的肌導肽可導致組織非特異性攝取增加，這已經(jīng)在臨床前研究和臨床試驗中得到驗證[21]；但是富精氨酸的肌導肽即使在低于誘導外顯子跳躍所需的劑量[22]也經(jīng)常引起非人類靈長類動物和人類的腎毒性，因此限制了其臨床的應用。

3 基因組編輯治療

基因組編輯技術是利用細胞自身的修復機制——非同源末端鏈接（Non-homologous end joining，NHEJ）或同源重組（Homologous Recombination，HR）所致隨機插入和/或缺失，在原基因座位修復突變基因。工程核酸酶可通過切割DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)的特定序列，誘發(fā)修復位點斷裂，從而達到原位基因編輯的目的（見圖4）。

圖4 基因組編輯原理示意圖

成簇間隔短回文重復序列（clusteredregularly interspersed short palindromic repeats，CRISPR）上游基因所編碼蛋白可在CRISPR 序列區(qū)誘導雙鏈DNA 斷裂，因此被命名為CRISPR 關聯(lián)基因（CRISPR associated，Cas）。CRISPR/Cas 系統(tǒng)因其具有識別外源DNA 并靶向誘導雙鏈DNA 斷裂，以沉默外源基因表達的功能而被開發(fā)成一種高效的基因編輯工具。

從2016 年開始，CRISPR/Cas 系統(tǒng)逐漸在體外培養(yǎng)的肌衛(wèi)星細胞、患者源性成肌細胞、人誘導多能干細胞源性肌肉細胞和mdx 小鼠模型中實現(xiàn)DMD 基因編輯，并可見Dys 水平恢復，部分骨骼肌和心肌肌力增強[23]。其中，人誘導多能干細胞源性肌肉細胞在目前研究中應用最廣泛。有研究者[24]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，通過NHEJ 修復45—55 外顯子之間的長達725kb 的突變片段,是目前CRISPR/Cas9 介導的基于NHEJ 修復的最大片段的DMD 缺失。另外，小鼠體內(nèi)研究顯示，經(jīng)基因組編輯治療獲得的多能干細胞分化形成的心肌與骨骼肌，可恢復正常Dys 水平。而采用患者自身誘導性多能干細胞在體外進行基因編輯修正后輸入患者體內(nèi)，盡可能避免異體移植帶來的免疫排斥反應，這是未來研究的新方向。

2018 年，Amoasii L 等[25]首次成功利用CRISPR/Cas9 技術對50 號外顯子缺失的DMD 犬模型完成外顯子跳躍治療。次年，Min YL 等[26]通過向44 號外顯子缺失的小鼠模型中注射重組AAV 包裝的Cas9 核酸酶和單向?qū)NA，可以恢復抗肌營養(yǎng)不良蛋白表達以及肌肉收縮能力的改善。這些研究表明，CRISPR-Cas 系統(tǒng)可以用于糾正導致DMD 的多種遺傳突變，并為永久糾正DMD 提供了潛在的基因治療前景。

然而，目前基因編輯治療仍處于體外細胞和動物實驗階段，對于應用于人體的安全性和有效性還需進一步臨床試驗證實。基因組編輯是在DNA 水平上進行的，因此被編輯基因產(chǎn)生的所有RNA 轉(zhuǎn)錄本來都是自身產(chǎn)生的，理論上這就排除了重復治療的需要；但基因編輯治療不能完全預防與DMD 相關的肌肉損傷，一旦發(fā)生大規(guī)模的肌肉損傷，多核纖維中前期已接受基因組編輯過的細胞核就會丟失。因此，患者仍有可能隨著時間的推移，部分Dys 水平逐漸下降。DMD基因組編輯治療的長期有效性，還需進行長期的研究。

基因組編輯治療也同樣面臨著機體對AAV 的免疫抵抗以及對AAV 載體的大量需求。此外，基因編輯方法也面臨著獨特的挑戰(zhàn)，比如，已知Cas9 可以在目標位點以外的地方誘導DNA 斷裂[27]，產(chǎn)生脫靶效應，導致DNA 的永久改變。

由于DMD 基因突變類型的多樣性，單一設計的CRISPR／Cas9 基因編輯方法不能完全治療所有類型DMD 患者，未來還需研究發(fā)現(xiàn)更加特異、高效的內(nèi)切酶工具，提高基因編輯的安全性、有效性，加速最終治療DMD 患者的進程。

4 終止密碼子通讀治療

無義突變是由于某單一堿基突變使氨基酸密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子的點突變，提早出現(xiàn)的終止密碼子引起mRNA退變，提前終止蛋白質(zhì)翻譯，產(chǎn)生截短的、無功能的蛋白質(zhì)。終止密碼子通讀治療又稱為無義突變通讀治療，一些化合物通過與核糖體的結(jié)合，阻止終止密碼子的信號識別，從而跳過這個錯誤的終止密碼子，誘導提早出現(xiàn)的終止密碼通讀，從而繼續(xù)翻譯Dys（見圖5）。該方法適用于所有無義突變DMD 患者，其占總患者人群的10%～15%[28]。

圖5 終止密碼子通讀治療原理

研究發(fā)現(xiàn)，在mdx 小鼠中，慶大霉素可誘導Dys 的高表達，增加肌肉的收縮能力[29]；但慶大霉素的耳毒性和腎毒性限制了在DMD 治療中的應用。高通量篩選已經(jīng)確定了Ataluren（PTC124，商品名Tranlsarna）為一種蛋白修復藥物，能夠降低核糖體對過早終止密碼子的敏感性，具有潛在的終止密碼子讀取能力，造成所謂“終止密碼子通讀”[30]，且具有比慶大霉素更好的安全性。

一項治療前后的比較研究發(fā)現(xiàn)，Ataluren 可使Dys 表達增加11%[31]。Bushby K 等[32]進行了一項隨機雙盲多中心試驗，174 例5～20 歲的無義突變DMD 的男性患兒，接受了為期48 周的Ataluren 治療，治療中無嚴重不良事件報道，Ataluren 具有良好的安全性與耐受性，40 mg·（kg·d）-1劑量治療組比對照組6MWT 增加了31.3 m。薈萃分析結(jié)果顯示，Ataluren 對6MWT 為300～400 m 的患者治療效果顯著[33]，且可以維持肌肉功能。2014 年EMA 對年齡≥5 歲的無義突變患者予以有條件批準使用Ataluren 治療。Ataluren 的主要缺點是只適用于具有無義突變的個體（約13%的DMD 患者[34]），并且與其他治療罕見疾病的藥物一樣，價格昂貴。由于代理商的市場和價格在每個國家都是單獨協(xié)商的，因此Ataluren目前只在歐洲個別國家應用。

5 小 結(jié)

DMD 的治療在近十幾年中發(fā)展迅速，特別是在基因治療領域，包括治療方法的多樣化及基因載體的不斷改進，整體前景令人期待。目前已有兩種藥物獲得批準，另有數(shù)十種藥物正在進行臨床試驗，眾多的治療方法對DMD 小鼠和GRMD 的犬模型中都已經(jīng)展現(xiàn)出較好的治療效果；但應用于臨床仍需克服許多障礙，有待于進一步優(yōu)化和更多的研究支持?；蛱娲煼ā⑼怙@子跳躍技術、基因組定向編輯以及終止密碼子通讀治療適用于不同類型的DMD 患者,都有著各自的優(yōu)勢和不足之處（如表1 所示），相信曾經(jīng)無藥可治的DMD 在不久的未來會在研究者們共同的努力下最終被攻克。

表1 4 種基因療法歸納總結(jié)