LC-MS/MS 法測定人血漿中的非洛地平濃度

許 珩，洪富美，*，趙 莉

1 徐州醫(yī)科大學，徐州 221004;2 徐州立新佳正醫(yī)藥科技有限公司，徐州 221100

非洛地平（felodipine）是一種對血管具有高選擇性的二氫吡啶類鈣離子拮抗劑，主要抑制小動脈平滑肌細胞外鈣離子的內流，選擇性擴張小動脈，又因其對靜脈平滑肌和腎上腺素血管張力調節(jié)無影響，故不引起體位性低血壓；適用于各型高血壓、缺血性心臟病及心力衰竭的治療[1，2]。臨床應用廣泛；但非洛地平會引起嚴重性低血壓和心動過緩，故對老年患者采取治療藥物監(jiān)測，尤為重要。

由于非洛地平給藥劑量小，血藥濃度低且遇光不穩(wěn)定，常規(guī)測定方法難以滿足人體藥動學研究的需要。在現(xiàn)有文獻中，大多采用液液萃取法或固相萃取法。余鵬[2]等采用乙醚-正己烷（1∶1，v∶v）對血漿樣本進行萃取，毒性較大，血漿使用量多，步驟繁瑣，成本高昂；吳正宇[3]等使用固相萃取板對血漿樣本進行萃取，但檢測缺點并未改觀。

本研究采用高效液相色譜-質譜法測定人血漿中非洛地平濃度，生物樣本前處理簡單快捷、回收率較好、無明顯基質效應、分析時間較短僅為3.5 min，有利于制備大量樣本并進行高通量分析，從而縮短研究時間，節(jié)約成本，提高經濟效益，適用于非洛地平的臨床血藥濃度檢測及生物等效性實驗。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

ExionLCTM 高效液相色譜，TRIPLE QUADTM6500+三重四級桿串聯(lián)質譜儀（均美國AB SCIEX公司）；MSA6.6S-0CE-DM 百萬分之一天平（德國Sartorius 公司）。

1.2 藥品與試劑

非洛地平對照品（純度：99.6%，批號：100717-201403，中國食品藥品檢定研究院，校正因子：0.99600）；非洛地平-d3內標[純度：96%（化學純）、99.9%（同位素純度）、99.83%（歸一化強度），校正因子：96%×99.9%×99.83%=0.95741），批號：4-RFS-1-1,加拿大Toronto Research Chemicals]；乙腈、醋酸銨均為HPLC 純度（美國J.T.Baker）；甲酸為ACS純度；水為超純水。

2 方 法

由于非洛地平在光照下不穩(wěn)定，易降解，所以本實驗過程中注意避光。采用雙標準曲線進行定量分析，每個分析批制備兩條標準曲線。

2.1 檢測條件

色譜條件：色譜柱為Waters Xbridge-C18（2.1mm×50 mm，3.5 μm）；流動相A 為水/甲酸/1 mol·L-1醋酸銨（100/0.2/0.1，v/v/v），流動相B 為乙腈/甲酸/1 mol·L-1醋酸銨（100/0.2/0.1，v/v/v），梯度洗脫，程序見表1；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃，進樣體積：20 μL。分析時間為3.5 min。

表1 梯度洗脫程序

質譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），以質譜多重反應監(jiān)測（MRM）方式進行正離子檢測，檢測離子分別為m/z 384.2→352.0（非洛地平），m/z 387.2→351.9（非洛地平-d3）。質譜檢測器的主要參數(shù)：氣簾氣（CUR）207 kPa、碰撞氣（CAD）55 kPa，電離子噴霧氣壓（IS）5500 V，溫度400 ℃，離子源氣體1103 kPa，離子源氣體1655 kPa，非洛地平和非洛地平-d3的離子去簇電壓（DP）均為35 V，入口電壓（EP）均為12 V，碰撞活化電壓（CE）均為19 V，碰撞室出口電壓（CXP）均為11 V。

數(shù)據(jù)的采集和處理均使用Analyst 1.6.3 軟件。

2.2 溶液的配制

精密稱取非洛地平對照品及非洛地平-d3內標適量，用乙腈/水（50/50，v/v）分別配制成濃度為100 ng·μL-1的儲備液，置于4 ℃冰箱備用。用乙腈/水（50/50，v/v）稀釋儲備液配制成不同濃度的非洛地平工作溶液以及0.08 ng·μL-1內標工作溶液。

2.3 血漿樣品預處理

精密吸取血漿樣品200 μL 于96 深孔板中，添加0.08 ng·μL-1內標溶液10 μL 至每一樣本，空白及殘留樣本添加10 μL 的乙腈/水（50/50，v/v）。混勻后加入乙腈800μL，20℃下以4000r·min-1離心10min，轉移700 μL 上清液至另一96 深孔板中，于純凈氮氣流下，40°C 蒸發(fā)干燥，固體物中加入250 μL 乙腈/水/甲酸/1 mol·L-1醋酸銨（55/45/0.2/0.1，v/v/v/v）復溶，進樣20 μL，進行LC-MS/MS 分析。

2.4 標準血漿樣本及質控樣本的配制

在1.5 mL EP 管中，分別加入570 μL 空白血漿與30 μL 相應濃度非洛地平的標準曲線用工作溶液或質控用工作溶液，渦旋混勻即可得到0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1、3.2、4 ng·mL-1濃度的標準血漿樣本及0.02、0.06、0.35、2、3 ng·mL-1濃度的質控樣本。

另配制空白樣本、殘留樣本及零濃度樣本各600 μL。按“2.3”項預處理，殘留樣本為未添加分析物與內標的空白樣本，按樣本步驟制備后，接續(xù)于每一個分析批的校正標樣ULOQ 后分析，以評估殘留效應。

3 方法學驗證及結果

3.1 選擇性測試

選取6 個不同來源的空白血漿樣本以及3 個不同來源的空白溶血血漿樣本，并分別按“2.4”項下配制標準血漿樣品，以評價空白血漿對分析物及內標的干擾；另制備定量上限樣本（ULOQ）于空白樣本（無內標），以評價分析物對內標的干擾。同時，利用該分析批的零濃度樣本，進行內標對分析物的干擾評估。按“2.3”項下方法處理，按“2.1”檢測條件進樣分析，并記錄色譜圖。在符合非洛地平保留時間處的干擾峰響應均低于該分析批的標準曲線中定量下限樣本（LLOQ）的非洛地平響應的20.0%；在符合內標保留時間處的干擾峰響應均低于該分析批的標準曲線中定量下限樣本的內標響應的5.0%，見圖1。

圖1 典型血漿樣品色譜圖

非洛地平和非洛地平-d3的保留時間（RT）分別在1.415 min 左右和1.417 min 左右，峰形良好，血漿中的內源性物質不干擾本品及其內標的測定。

3.2 提取回收率和基質效應

按“2.4” 方法配制0.06、2、3 ng·mL-1（QL、QM、QH）3 個濃度的對照品血漿樣品，QL 為3 倍的標準曲線定量下限（LLOQ）濃度，QM 為標準曲線定量上限（ULOQ）的50%，QH 為標準曲線定量上限（ULOQ）的75%。每個濃度平行3 個樣本，按“2.3”項下方法處理，即為制備后樣本。取空白血漿200 μL，按“2.3”項下從“空白及殘留樣本添加10 μL 的乙腈/水（50/50，v/v）”開始操作，即為非制備后樣本，非制備后樣本共三個濃度，每個濃度制備3 個平行樣本。選擇6 種不同來源的空白人血漿，操作同非制備后樣本，即為基質效應測試樣本，每個濃度制備6個平行樣本（每個來源1 個）。配制低、中、高3 種濃度的分析物復溶液（分析物濃度分別為0.0336、1.12、1.68 ng·mL-1，內標為2.24 ng·mL-1，溶液中分析物與內標濃度按QL、OM、QH 上機濃度進行回算），用以復溶非制備后樣本、基質效應測試樣本、不含生物基質的樣本(以純水為基質)。不含生物基質的樣本操作同基質效應測試樣本，每個濃度1 個樣本，每個樣本分析6 次。復溶后三者的上機濃度與QL、QM、QH 相同。計算提取回收率（制備后樣本的平均響應值/非制備后樣本的平均響應值）與內標歸一化基質因子（分析物基質因子=含基質的分析物樣本響應/不含基質的分析物樣本響應平均值，內標基質因子=含基質的內標樣本響應/不含基質的內標樣本響應平均值，內標歸一化基質因子=分析物基質因子/內標基質因子），計算結果見表2。

表2 準確度、精密度、提取回收率與基質效應的測定結果

對此表明，分析物和內標的提取回收率達到預定標準，非洛地平無明顯空白血漿基質效應，不影響分析物的定量分析。

3.3 標準曲線與最低定量限（LLOQ）

按“2.4”項方法配制8 個濃度級別的系列標準血漿樣品，按“2.3”項方法處理并進行分析，記錄非洛地平與非洛地平-d3的色譜峰面積。共制備分析批10 個，每個分析批含2 條標準曲線，一共20 條標準曲線。以分析物（非洛地平）與內標（非洛地平-d3）的色譜峰面積比值（Y）為縱坐標，血漿中分析物的濃度（X）進行線性回歸，加權為1/X2，得到非洛地平的線性回歸方程：Y=0.267X-8.01×10-5（r=0.998 9），結果表明非洛地平在0.02～4 ng·mL-1與峰面積線性關系良好，最低定量限為0.019 62 ng·mL-1（準確度在80%～120%，精密度RSD＜20%）。

3.4 準確度與精密度試驗

按“2.4”項方法配制0.02、0.06、0.35、2、3 ng·mL-15 種不同濃度的質控樣本，每個濃度至少進行6 個樣品分析，共測定3 個分析批，按“2.3”項下方法處理，非洛地平的批內、批間準確度和精密度結果見表2。結果表明，5 種不同濃度的批內、批間準確度和精密度偏差均小于15%，符合生物樣本測試的要求。

3.5 穩(wěn)定性考察

按“2.4”項方法配制0.06、3 ng·mL-12 種濃度含藥血漿樣品，每一濃度平行3 個樣本。樣本在室溫放置52 h 后處理，測定濃度，測定值與0 h 的平均偏差分別為11.2%、4.5%；處理樣本后于自動進樣器（15℃）中放置59 h，測定值與0 h 的平均偏差分別為9.7%、3.1%；處理樣本后于4 ℃冰箱中放置50 h，測定值與0 h 的平均偏差分別為9.5%、4.6%。于-20 ℃下凍融樣本5 次后，無輔助解凍，測定值與0 h 的平均偏差分別為6.5%、5.9%，水浴解凍，測定值與0 h的平均偏差分別為3.3%、5.6%；于-80 ℃下凍融樣本5 次后，無輔助解凍，測定值與0 h 的平均偏差分別為4.7%、3.3%，水浴解凍，測定值與0 h 的平均偏差分別為-1.2%、1.1%。在-20℃冰箱儲存樣本32 d后，測定值與0 h 的平均偏差分別為-0.1%、1.0%；在-80 ℃冰箱儲存樣本32 d 后，測定值與0 h 的平均偏差分別為0.4%、-3.2%。結果表明，非洛地平在各考察條件下均具有良好的穩(wěn)定性。

3.6 殘留效應

在每個分析批最高濃度的校正標樣（ULOQ）后面進樣空白樣本作為殘留測試樣本。殘留測試樣本在分析物保留時間處的干擾峰的響應均低于該標準曲線中定量下限樣本中非洛地平響應的20.0%，內標保留時間處的干擾峰的響應均低于定量下限樣本中內標響應的5.0%。結果表明，該方法殘留可忽略不計，不影響定量分析。

3.7 方法應用

本試驗經過常州市第二人民醫(yī)院醫(yī)學研究倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。12 位受試者隨機分為兩組，均在空腹狀態(tài)下單次口服5 mg非洛地平緩釋片受試制劑和參比制劑。第一個周期，第一組給予受試制劑，第二組給予參比制劑。經過7 天的清洗期后，進行交叉互換。第二周期，第一組給予參比制劑，第二組給予受試制劑。測定其服藥前（0 h）及服藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9、10、12、24、36、48 h 的非洛地平血藥濃度，受試制劑與參比制劑的Cmax分別為（1.56±1.15）ng·mL-1、（1.39±1.09）ng·mL-1，藥-時曲線吸收、分布、消除形態(tài)基本完整，見圖2。

圖2 受試者口服受試、參比制劑血漿中非洛地平的藥-時曲線

4 討論

非洛地平具有光不穩(wěn)定性，在溶液和血漿樣本中經室內日光燈照射10 min 后降解率即超過15%[4]，應選用避光的儲備容器，并在避光條件下進行實驗。

本實驗采用LC-MS/MS 法，具有色譜分離與質譜分離的雙重功能，依靠質譜的分辨能力區(qū)分不同物質的色譜峰，抗干擾能力強。本實驗采用蛋白質沉淀法進行生物樣本前處理，操作簡單快捷且定量下限更低，為0.01962 ng·mL-1；但提取回收率與基質效應結果、批內、批間準確度與精密度尚存在不足。本實驗方法應用樣本量較少，結果存在個體差異，后續(xù)需擴大樣本量。非洛地平臨床應用劑量小，血藥濃度極低，對分析方法的穩(wěn)定性要求較高，在優(yōu)化色譜過程中，選用Waters Xbridge-C18（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）色譜柱，可以獲得較好的峰形及較佳的保留時間，空白基質背景較低，可以較好地分離分析物和排除雜質干擾。本實驗考察了甲酸和醋酸銨對色譜行為的影響，結果發(fā)現(xiàn)，甲酸的加入為非洛地平提供了對稱峰形，添加醋酸銨增強了對分析物的保留。本方法每個分析批制備兩條標準曲線使定量更加準確。采用穩(wěn)定同位素內標，其與待測物分子性質一致，可最大限度地消除分析方法的誤差，干擾小、定量結果準確、穩(wěn)定、變異性小。在文獻[3，4]中，分析時間均大于5 min，本實驗分析時間僅為3.5 min，縮短了樣本的分析周期，有利于大樣本待測物的分析，提高工作效率，節(jié)約成本，能滿足非洛地平緩釋片的人體藥動學及生物等效性的研究。