LC-MS/MS 法測定人血漿中沙丙蝶呤的濃度

王月玥，林明弘，2*

1 徐州醫(yī)科大學(xué)，徐州 221000；2 徐州立興佳正醫(yī)藥科技有限公司，徐州 221009

沙丙蝶呤（Sapropterin），也稱四氫生物蝶呤（Tetrahydrobiopterin，BH4），是一氧化氮合酶的輔助因子，是一種內(nèi)源性物質(zhì)，存在于高等動物每個細(xì)胞和組織中，參與多個生理和病理過程，在酶促反應(yīng)中作為電子載體，起到還原劑的作用。BH4很容易被氧化成二氫生物蝶呤（Dihydrobiopterin，BH2）和生物蝶呤（Biopterin，B），BH2也容易被氧化成B；但只有BH4能夠提供合適的輔助因子功能。BH4不足或催化BH4再生的還原酶缺陷，是導(dǎo)致苯丙氨酸羥化反應(yīng)受阻、出現(xiàn)苯丙酮尿癥的原因之一[1]，目前已有相應(yīng)的藥物制劑應(yīng)用于臨床治療[2]。鹽酸沙丙蝶呤（sapropterin dihydrochloride）是美國FDA 批準(zhǔn)的首個治療由于BH4缺乏所導(dǎo)致苯丙酮尿癥的特異性藥物[3]。該藥物療效確切、服用方便、安全性較高[4]；但關(guān)于此藥的相關(guān)報道較少，因此有必要建立快速、簡便、可靠的人體血藥濃度測定方法，有利于開展BH4的藥代動力學(xué)研究，為制劑開發(fā)和臨床合理用藥提供指導(dǎo)，保證用藥安全。

沙丙蝶呤不穩(wěn)定，很容易被氧化，這對血液樣本的處理和分析造成較大的難度。近年來，國內(nèi)外多采用選擇性好、分析速度快的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）來測定沙丙蝶呤的血藥濃度。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)[5-8]報道，通過測定血漿中B 的濃度來間接確定BH4的濃度[7]，在處理生物樣本的過程中采取低溫萃取或者通過衍生化等處理方法[5]；但樣本處理過程都比較繁瑣，分析時間普遍較長，線性范圍較小，不適用于大量臨床或非臨床樣本的分析。

本研究采用較為簡便的蛋白質(zhì)沉淀法處理生物樣本，在此過程中分批次加入不同濃度的抗氧化劑（抗壞血酸，VC）用于穩(wěn)定BH4，避免發(fā)生氧化反應(yīng)，從而能夠直接測定人血漿中的BH4濃度，具有穩(wěn)定性好、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、樣本處理簡單的特點(diǎn)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

對照品：沙丙蝶呤（來源：Clearsynth Inspiring Research；批號：CS-WS-AAA-1982-02；純度：99.44%）；沙丙蝶呤-13C15N3（來源：Clearsynth Inspiring Research；批號：CS-SAT-426；純度：91.18%（Purity），97.25%（Isotopic enrichment））。受試制劑：鹽酸沙丙蝶呤片（鹽酸沙丙蝶呤，100 mg，口服片劑，市售）；參比制劑：Kuvan?（鹽酸沙丙蝶呤，100 mg，口服片劑，自制）。

乙酸銨、甲醇、乙腈（制造商：J.T.Baker，級別：HPLC）；抗壞血酸（VC，制造商：SIGMA-ALDRICH，級別：ACS）；鹽酸（制造商：Greagent，級別：AR）；純水由德國Sartorius 公司的純水制造機(jī)制備。

人空白血漿來源：購買和采集于志愿者。

1.2 儀器

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX 公司）：包括液相泵（型號：AC Pump）、脫氣機(jī)（型號：AC Degasser）、自動進(jìn)樣器（型號：AC Autosampler）、柱溫箱（型號：AC Column Oven）、樣本架（型號：AC Rack Changer）、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（Analyst 1.6.3（software））、三重四級桿質(zhì)譜儀（型號：QTRAP?6500+）；百萬分之一天平（德國Sartorius 公司，型號：MSA6.6S-0CE-DM）；千分之一天平（德國Sartorius 公司，型號：BSA623S）；離心機(jī)（德國HERMLE公司，型號：Z513K）；多試管渦旋混合儀（中國米歐儀器有限公司，型號：DMT-2500）。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱：Kinetex? EVO C18100A?（4.6 mm×100 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流動相：含0.1% 1 mol·L-1的乙酸銨水溶液∶乙腈=93∶7（v/v)；自動進(jìn)樣器溫度：6 ℃；流速：0.6 mL·min-1；進(jìn)樣量：15 μL；分析時間：3 min。

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式檢測，掃描方式為多反應(yīng)檢測（MRM）。儀器參數(shù)設(shè)置為：氣簾氣壓 力（CUR）：138 kPa，碰撞氣壓 力（CAD）：High，離子源噴射電壓（IS）：2800 V，溫度（TEM）：650 ℃，霧化氣壓力（GS1）：586 kPa，輔助氣壓力（GS2）：586 kPa，去簇電壓（DP）：20 eV，碰撞室入口電壓（EP）：10 eV，碰撞能量（CE）：26 eV，碰撞室出口電壓（CXP）：10 eV。沙丙蝶呤和內(nèi)標(biāo)沙丙蝶呤-13C15N3的檢測目標(biāo)離子對分別為m/z 242.3→166.1和m/z 246.1→170.2。

2.3 溶液的配制

2.3.1 抗氧化劑溶液 稱取VC 約12.5g，用含0.1mol·L-1鹽酸的甲醇水溶液（甲醇∶水=50∶50，v/v）定容至250 mL，配制成5%的VC 溶液；稱量VC 約50 g，用含0.1 mol·L-1鹽酸的甲醇水溶液（甲醇∶水=1∶99，v/v）定容至250 mL，配制成20%的VC 溶液Ⅰ；稱量VC 約50 g，用含0.02 mol·L-1鹽酸的甲醇水溶液（甲醇∶水=1∶99，v/v）定容至250 mL，配制成20%的VC溶液Ⅱ。由于VC 遇光、熱不穩(wěn)定，故配制過程需在避光條件下進(jìn)行，配制好的溶液于4 ℃冷藏柜避光保存。

2.3.2 沙丙蝶呤儲備液 精密稱取沙丙蝶呤對照品1.025 mg，用5%的VC 溶液溶解并稀釋配制成濃度約為100 ng·μL-1的儲備液-Ⅰ。再精密稱取沙丙蝶呤對照品1.019 mg，用5%的VC 溶液溶解并稀釋配制成濃度約為100 ng·μL-1的儲備液-Ⅱ，配制過程在避光條件下進(jìn)行，配制好的溶液于-20 ℃冰箱避光保存。

2.3.3 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取沙丙蝶呤-13C15N31.115mg，用5%的VC 溶液溶解并稀釋配制成濃度約為50 ng·μL-1的儲備液，用5%的VC 溶液稀釋儲備液，配制成0.2 ng·μL-1的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液。配制過程在避光條件下進(jìn)行，配制好的溶液于-20 ℃冰箱避光保存。

2.4 血漿樣品處理

在96 深孔板中加入含藥血漿樣品100 μL，添加0.2 ng·μL-1內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液5 μL 和20%VC 溶液Ⅱ25 μL 并渦旋混勻，添加甲醇500 μL 進(jìn)行蛋白沉淀，渦旋混合1 min，于6 ℃條件下3000 r·min-1離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液150 μL 至裝有800 μL 含0.1%1 mol·L-1的乙酸銨水溶液的96 深孔板中，并渦旋混勻，于6 ℃條件下3000 r·min-1離心5 min，進(jìn)行LC-MS/MS 定量分析。整個制備過程均在冰浴和避光條件下進(jìn)行。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本及質(zhì)控樣本的配制和處理

將人空白血漿與20%VC 溶液Ⅰ按照19∶1 的比例進(jìn)行預(yù)處理。將“2.3.2”配制的沙丙蝶呤儲備液-Ⅰ用5% VC 溶液稀釋，配制成濃度分別為0.02、0.04、0.1、0.2、1、2、4、6 ng·μL-1的沙丙蝶呤系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在預(yù)處理過的空白血漿中加入系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成濃度分別為1、2、5、10、50、100、200、300 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線用標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣本。后續(xù)處理同“2.4”項(xiàng)。

將“2.3.2”配制的沙丙蝶呤儲備液-Ⅱ用5% VC溶液稀釋，配制成濃度分別為0.2、4 ng·μL-1的沙丙蝶呤標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述預(yù)處理過的空白血漿，配制成濃度分別為1、3、30、150、250 ng·mL-1的質(zhì)控用標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣本，后續(xù)處理同“2.4”項(xiàng)。

2.6 臨床樣本測定

選取10 例健康男性和女性受試者，在健康男性和女性受試者中于空腹情況下評價受試制劑[鹽酸沙丙蝶呤片（鹽酸沙丙蝶呤，100 mg，口服片劑）]和參比制劑[Kuvan?（鹽酸沙丙蝶呤，100 mg，口服片劑）]的吸收速度和程度。受試者將在第一周期中接受受試制劑，然后在至少7 天清洗期后，在第二周期接受參比制劑。在每個周期中，于給藥前（-1、-0.5、0 h）和給藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、8、9、10、12、14、24、36、48 h 共計24 個時間點(diǎn)采集血樣，每次取血4 mL，用于血漿中沙丙蝶呤的分析。上述樣本處理同“2.4”項(xiàng)。

3 結(jié)果

3.1 質(zhì)譜掃描

在“2.2 質(zhì)譜條件”下，沙丙蝶呤與沙丙蝶呤-13C15N3主要產(chǎn)生m/z 242.3、m/z 246.1 的[M+H]+峰，選擇性地對[M+H]+峰進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描，沙丙蝶呤與沙丙蝶呤-13C15N3的主要離子碎片為m/z 166.1、m/z 170.2。將這些主要碎片離子作為定量分析時檢測的產(chǎn)物離子。沙丙蝶呤與沙丙蝶呤-13C15N3的產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 沙丙蝶呤產(chǎn)物（A）和沙丙蝶呤-13C 15N3 產(chǎn)物（B）離子掃描圖

3.2 選擇性測試

取6 份不同來源的、經(jīng)抗氧化劑預(yù)處理過的人空白血漿和3 份預(yù)處理過的不同來源的空白溶血血漿，除不加內(nèi)標(biāo)（改為加同等體積的5%VC 溶液）外，其余按照“2.4”項(xiàng)方法處理。考察空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)是否對待測物和內(nèi)標(biāo)產(chǎn)生干擾。

沙丙蝶呤和內(nèi)標(biāo)沙丙蝶呤-13C15N3的保留時間分別為1.88 min 左右和1.87 min 左右，6 個不同來源的空白血漿中的干擾組分的響應(yīng)不大于當(dāng)批次定量下限分析物響應(yīng)的10.2%，符合小于20.0%的接受標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值不大于當(dāng)批次定量下限內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的0.4%，符合小于5.0%的接受標(biāo)準(zhǔn)，表明人血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾分析物和內(nèi)標(biāo)的定量分析。

3.3 特異性干擾評估

制備定量上限濃度于人血漿空白樣本中，除不加內(nèi)標(biāo)（改為加同等體積的5%VC 溶液）外，其余按照“2.4”項(xiàng)方法處理，與選擇性測試分析批一同制備分析，考察分析物對內(nèi)標(biāo)的干擾；另外，在分析批中制備一個空白對照樣本（只加內(nèi)標(biāo)不加分析物的樣本），考察內(nèi)標(biāo)對分析物的干擾。

在空白對照樣本中，分析物的響應(yīng)值占當(dāng)批次定量下限分析物響應(yīng)值的6.4%，符合小于20.0%的接受標(biāo)準(zhǔn)，表明沙丙蝶呤-13C15N3對沙丙蝶呤樣品的干擾可忽略不計；在定量上限濃度樣品中，內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)值占當(dāng)批次定量下限內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的0.2%，符合小于5.0%的接受標(biāo)準(zhǔn)，表明沙丙蝶呤對內(nèi)標(biāo)沙丙蝶呤-13C15N3的干擾可忽略不計。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限

將“2.5”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線用標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣本，按照“2.4”項(xiàng)方法處理，以分析物濃度（ng·mL-1）為橫坐標(biāo)X，分析物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)Y，用加權(quán)（W=1/X2）最小二乘法進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=aX+b。

沙丙蝶呤的線性范圍為1～300 ng·mL-1，典型回歸方程為Y=5.72×10-2X+2.57×10-3，r=0.999 9，表明線性關(guān)系良好。當(dāng)沙丙蝶呤定量下限樣品濃度為1 ng·mL-1時，其批內(nèi)與批間平均準(zhǔn)確度偏差（RE%）在標(biāo)示值的±20.0%范圍內(nèi)，變異系數(shù)（CV%）在標(biāo)示值的±20.0%范圍內(nèi)，因此，本分析方法靈敏度達(dá)到要求。

3.5 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)

5 個濃度的質(zhì)控樣本（1、3、30、150、250ng·mL-1），每個濃度分別進(jìn)行6 重復(fù)、6 重復(fù)和14 重復(fù)，這樣連續(xù)測定3 個分析批，按照“2.4”項(xiàng)方法處理，使用當(dāng)批次校準(zhǔn)曲線計算各個質(zhì)控樣品的濃度，考察該分析方法的精密度與準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1。表明沙丙蝶呤在各濃度質(zhì)控樣本的批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度符合有關(guān)生物樣本分析方法的驗(yàn)證要求。

表1 血漿中沙丙蝶呤方法精密度與準(zhǔn)確度測定結(jié)果

3.6 重新進(jìn)樣試驗(yàn)

考察在“3.5”項(xiàng)中14 重復(fù)測定的質(zhì)控樣本，在第一次分析結(jié)束后置于自動進(jìn)樣器中91 h（時間的計算：首次進(jìn)樣開始的時間和批次再次進(jìn)樣開始時間的間隔）再次進(jìn)樣，沙丙蝶呤5 個濃度水平的質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度平均值在100.2%～104.4%，批內(nèi)精密度在2.2%～3.9%，結(jié)果表明，經(jīng)處理過的樣本在自動進(jìn)樣器內(nèi)可放置至少91 h，重新進(jìn)樣具有良好的重現(xiàn)性。

3.7 基質(zhì)效應(yīng)

考察空白血漿基質(zhì)效應(yīng)從低（3 ng·mL-1）、中（150 ng·mL-1）、高（250 ng·mL-1）3 種濃度進(jìn)行，每個濃度分別用6 個不同來源的空白樣品，按樣品制備步驟制備后加入含分析物和內(nèi)標(biāo)的溶液，配制成相當(dāng)于低（3 ng·mL-1）、中（150 ng·mL-1）、高（250 ng·mL-1）3 種濃度的樣品，即含生物基質(zhì)的樣品。每個樣品分析1 次。同時，以純水為基質(zhì)，且按樣品制備步驟制備后加入含待測物及內(nèi)標(biāo)的溶液，配制成相當(dāng)于低（3 ng·mL-1）、中（150 ng·mL-1）、高（250 ng·mL-1）3 種濃度的樣品，即不含生物基質(zhì)的樣品。不含生物基質(zhì)的樣品每個濃度1 個樣品，每個樣品分析6 次。以此作為對照，考察空白基質(zhì)效應(yīng)。

低、中、高3 種濃度的沙丙蝶呤內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子的變異系數(shù)（CV%）分別為1.9%、1.3%、1.9%，結(jié)果表明，沙丙蝶呤無明顯的空白血漿基質(zhì)效應(yīng)，不影響待測物的定量分析。

3.8 回收率試驗(yàn)

將“2.3.2”項(xiàng)下方法配制沙丙蝶呤儲備液-Ⅰ，用5% VC 溶液稀釋，配制成濃度分別為0.06、3、5 ng·μL-1的沙丙蝶呤標(biāo)準(zhǔn)溶液，在100 μL 預(yù)處理過的空白血漿中加入5 μL 濃度為0.06、3、5 ng·μL-1沙丙蝶呤標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別制備低、中、高3 種濃度的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，每個濃度平行樣本3 支，按“2.4”項(xiàng)方法處理，作為回收率試驗(yàn)的提取樣本；另外，經(jīng)預(yù)處理過的空白血漿直接按“2.4”項(xiàng)方法處理（不含分析物與內(nèi)標(biāo)），經(jīng)蛋白沉淀步驟后，加入5 μL 濃度為0.06、3、5 ng·μL-1沙丙蝶呤標(biāo)準(zhǔn)溶液和5 μL 的0.2 ng·μL-1內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按配制低、中、高3 種濃度標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿的量，然后繼續(xù)制備，每個濃度平行樣本3 支，作為回收率試驗(yàn)的未提取樣本。提取樣本與未提取樣本的最后樣本組成應(yīng)相同，于同一分析批中進(jìn)樣分析，以儀器響應(yīng)值進(jìn)行評價。沙丙蝶呤的提取回收率公式（同法計算內(nèi)標(biāo)）：

提取回收率（%）=提取樣本的平均響應(yīng)值（峰面積）/未提取樣品的平均響應(yīng)值（峰面積）×100%

沙丙蝶呤低、中、高3 種濃度的平均提取回收率分別為98.0%、101.2%、98.1%，平均提取回收率為99.1%，回收率的變異系數(shù)（CV%）為1.8%；內(nèi)標(biāo)的平均提取回收率為92.3%。結(jié)果表明，該樣品處理方法的回收率較高，不會對樣品的分析產(chǎn)生影響。

3.9 稀釋測試

用經(jīng)預(yù)處理過的空白基質(zhì)配制高于高濃度質(zhì)控樣本（250 ng·mL-1）5 倍的樣本，將該樣本與空白基質(zhì)以1∶4（高濃度樣本∶空白基質(zhì)）的體積配制，即5 倍稀釋，平行操作5 次，將稀釋后的樣本按“2.4”項(xiàng)方法處理。考察該方法下高濃度樣本稀釋后是否依然能夠準(zhǔn)確定量。

高濃度樣品稀釋5 倍后測定濃度的平均準(zhǔn)確度為107.3%，變異系數(shù)（CV%）為1.7%，結(jié)果表明，對于超過定量上限的樣品，進(jìn)行5 倍稀釋后依舊可以準(zhǔn)確定量分析，此為待測物濃度超過定量上限樣品濃度、但不超過5 倍定量上限濃度的樣品進(jìn)行5倍稀釋后的測定提供了依據(jù)。

3.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

考察沙丙蝶呤標(biāo)準(zhǔn)溶液100、6、0.02 ng·μL-1和內(nèi)標(biāo)沙丙蝶呤-13C15N3標(biāo)準(zhǔn)溶液50 ng·μL-1、0.2 ng·μL-1，在避光室溫放置16 h 和避光放置于-20 ℃冰箱10 d 的穩(wěn)定性，結(jié)果均良好。

用“2.5”項(xiàng)預(yù)處理過的空白血漿配制沙丙蝶呤低（3 ng·mL-1）、高（250 ng·mL-1）兩種濃度質(zhì)控血漿樣品，分別于避光室溫條件以及避光冰浴條件下放置7.5 h、-20 ℃和-80 ℃下反復(fù)凍融5 次（解凍條件分為無輔助條件和水浴條件）、-20 ℃下保存7 d 及-80 ℃下保存49 d。按“2.4”項(xiàng)方法處理樣本，每一濃度作3 個平行樣品，然后進(jìn)樣分析，見表2、表3。用“2.4” 項(xiàng)方法處理后的樣本于6 ℃自動進(jìn)樣器存儲104 h、在4 ℃冰箱下存儲95 h，然后進(jìn)樣，計算濃度，見表4。表明在上述考察條件下，沙丙蝶呤的穩(wěn)定性良好。

表2 血漿中沙丙蝶呤的短期和長期穩(wěn)定性（避光，n=3）

表3 血漿中沙丙蝶呤反復(fù)凍融5 次的穩(wěn)定性（避光，n=3）

表4 制備后樣本穩(wěn)定性（避光，n=3）

用空白全血，分別配制沙丙蝶呤低（3 ng·mL-1）、高（250 ng·mL-1）兩種濃度的全血樣品，緩慢混合均勻后立即取出適量，進(jìn)行低溫（4 ℃）離心后，各濃度取3 個血漿樣品。同時將剩余全血樣品放置于冰浴中，1.5 h 后，將樣品再緩慢混合均勻，立即取出適量，進(jìn)行低溫（4 ℃）離心，各濃度取3 個血漿樣品。按“2.4”項(xiàng)方法處理后分析，以評價樣品采集穩(wěn)定性。結(jié)果表明，1.5 h 平均峰面積比（峰面積比=待測物峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積）與0 h 平均峰面積比，差異符合不超過±20.0%的接受標(biāo)準(zhǔn)，表明全血中沙丙蝶呤在冰浴中放置至少1.5 h 的穩(wěn)定性良好。

3.11 殘留測試

殘留測試樣品為未添加分析物和內(nèi)標(biāo)的空白血漿樣品，按照“2.4”項(xiàng)方法處理后，續(xù)接于校準(zhǔn)曲線樣品最高濃度后進(jìn)行分析，考察殘留情況，所有分析批均列入考察。結(jié)果顯示，空白血漿樣品在分析物保留時間處的干擾峰的響應(yīng)值均低于當(dāng)批次定量下限樣本沙丙蝶呤響應(yīng)值的20.0%，內(nèi)標(biāo)保留時間處的干擾峰的響應(yīng)均低于定量下限樣品中內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5.0%，這表明殘留可忽略不計，不影響人血漿中沙丙蝶呤濃度的定量分析。

3.12 方法應(yīng)用

將所建立并已經(jīng)過驗(yàn)證的方法應(yīng)用于臨床受試者血漿樣本的分析。10 例健康受試者口服受試制劑和參比制劑的平均血藥濃度-時間曲線圖見圖2。后續(xù)研究將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，為沙丙蝶呤的生物等效性研究提供依據(jù)。

圖2 受試者口服受試制劑和參比制劑的平均血藥濃度-時間曲線圖

4 討論

在實(shí)驗(yàn)方法建立前，對色譜柱、流動相、內(nèi)標(biāo)及離子對的選擇等條件進(jìn)行了摸索，而后選擇了最佳的分析方法，并對該方法進(jìn)行了驗(yàn)證。建立了測定人血漿中沙丙蝶呤濃度的LC-MS/MS 法。

本實(shí)驗(yàn)采用QTRAP?6500+型三重四級桿質(zhì)譜儀，電噴霧電離源（ESI），事實(shí)上，沙丙蝶呤在正負(fù)離子檢測方式下均有響應(yīng)，但在正離子方式[M+H]+背景下噪音更低，質(zhì)譜響應(yīng)信號更強(qiáng)，且干擾少，因此選擇正離子檢測，沙丙蝶呤在二級掃描中得到主要碎片峰為m/z 166.1。

色譜柱的選擇基于實(shí)證研究，由于沙丙蝶呤是水溶性物質(zhì)，經(jīng)試驗(yàn)，使用色譜柱Kinetex?EVO C18100A?（4.6 mm×100 mm，5 μm），可以獲得較好的峰形，且空白基質(zhì)背景較低，可以較好地分離分析物和其他干擾雜質(zhì)。使用該色譜柱平衡時間短，分析時間短，可以滿足高通量快速檢測的要求，可在最短的運(yùn)行時間內(nèi)獲得分析物和內(nèi)標(biāo)的最佳峰形和質(zhì)譜響應(yīng)，具有良好的重現(xiàn)性。選擇0.1% 1 mol·L-1乙酸銨的水溶液-乙腈作為流動相，采用等度洗脫的方式，檢測物質(zhì)的峰形良好且能得到最佳的保留時間。另外，由于沙丙蝶呤不穩(wěn)定，經(jīng)試驗(yàn)，當(dāng)柱溫高于40 ℃時沙丙蝶呤有明顯的氧化反應(yīng)，因此將柱溫設(shè)置為30 ℃，保證沙丙蝶呤的穩(wěn)定性。

選用沙丙蝶呤-13C15N3為內(nèi)標(biāo)，其理化性質(zhì)、質(zhì)譜響應(yīng)、色譜行為、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)都與沙丙蝶呤相似，且對待測物的測定無干擾，適宜作為本方法的內(nèi)標(biāo)。

本方法采用甲醇作為蛋白質(zhì)沉淀劑，相比于已有文獻(xiàn)報道[5-8]方法而言，樣本的前處理更簡單，有利于大批量制備樣本，提高了工作效率。由于沙丙蝶呤的不穩(wěn)定性會影響到測定的準(zhǔn)確性，于是選擇在處理過程中分批次加入不同濃度組成的抗氧化劑抗壞血酸（VC），經(jīng)多次試驗(yàn)，在缺乏抗氧化劑或抗氧化劑濃度較低的情況下均不能準(zhǔn)確地測定沙丙蝶呤的濃度，而采用本法測定人血漿中的沙丙蝶呤，其穩(wěn)定性符合要求。

5 小 結(jié)

試驗(yàn)證明，采用本法測定人血漿中沙丙蝶呤的濃度，靈敏度高，專屬性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，定量準(zhǔn)確，精密度高且易于操作，可實(shí)現(xiàn)最低定量下限1 ng·mL-1的測定，分析時間短，分析效率高，可用于大量臨床或非臨床樣本的分析，具有一定的實(shí)用性。