快速溶劑萃取技術在2種食藥用真菌多糖提取中的應用

閆佳佳，萬 璐，吳 桐，鄭春英

（1黑龍江大學農業微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學生命科學學院/黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080；3黑龍江大學生命科學學院/黑龍江省普通高校分子生物學重點實驗室，哈爾濱 150080）

0 引言

快速溶劑萃取技術是近年發展起來的用于萃取固體或半固體樣品的前處理技術[1]，具有全自動、提取效率高、節能環保等特點[2]。隨著在食品藥品活性成分提取中的廣泛應用，該技術已逐漸應用到黃酮[3]、生物堿[4]、酚類化合物[5]等活性成分的提取中。關于快速溶劑萃取技術在多糖提取中的應用報道較少[6]，因此該技術在多糖提取方面還需要進行深入研究。

豬苓(Polyporus umbellatus)及茯苓(Poria cocos)是2種常用食藥用真菌，分別為多孔菌科真菌豬苓及茯苓的干燥菌核[7]，有著悠久應用歷史[8]。豬苓具有抗菌[9]、抗腫瘤[10]、抗炎[11]、抗病毒[12]、利尿[13]、護肝[14]等作用，其主要活性成分為豬苓多糖[15]、麥角甾醇[16]、生物堿[17]、甾體類化合物[18]等。茯苓具有利尿[19]、抗炎[20]、抗菌[21]、抗氧化[22]、抗腫瘤[23]、鎮靜[24]等作用，其主要活性成分包括茯苓多糖[25]、脂肪酸[26]、三萜類化合物[27]、甾體類化合物[28]等。在上述2種食藥用真菌活性成分中的多糖成分，因具有多種活性作用而備受關注[29]，并可作為食品的主要生產原料用于功能性保健食品的開發應用[30]。

豬苓多糖及茯苓多糖常用的提取方法包括熱水提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶提法等[31]，但上述方法存在提取效率低、提取時間長等缺點[32]。為提高這2種食藥用真菌多糖成分的提取率，并高效分析其多糖成分，筆者在前期研究的基礎上[33]，采用快速溶劑萃取法對豬苓及茯苓的多糖成分進行提取，以單因素及正交實驗優選快速溶劑萃取法提取2種食藥用真菌多糖的最佳工藝條件，以期為食藥用真菌多糖的研究提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬苓、茯苓購于黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，經黑龍江大學生命科學學院鄭春英教授鑒定為豬苓、茯苓。

供含量測定用葡萄糖對照品，純度＞99.8%，Amresco。

1.2 主要儀器

P/N 10503型快速溶劑萃取儀，美國Applied Separations生產。

1.3 方法

1.3.1 脫脂供試品的制備 分別取2種食藥用真菌樣品適量，加入乙醇（按料液比1:8加入），熱回流2 h，濾液棄去，取藥渣低溫干燥，即得脫脂供試品，備用。

1.3.2 2種食藥用真菌多糖的含量測定 采用蒽酮-硫酸法測定2種食藥用真菌多糖的含量[34]。以葡萄糖為對照，以標準曲線法計算2種食藥用真菌多糖的含量[35]。

1.3.3 單因素實驗

（1）PSE萃取溫度對2種食藥用真菌多糖的影響。精密稱取1.3.1項各樣品3.0000 g，置于PSE萃取池中，PSE萃取參數為壓力90 bar、提取時間20 min、循環2次，分別在70、80、90、100、110℃下，制備豬苓多糖、茯苓多糖萃取液，合并萃取液，采用1.3.2項的方法測定豬苓多糖和茯苓多糖的含量。

（2）PSE萃取壓力對2種食藥用真菌多糖的影響。按1.3.3（1）取樣，操作，PSE萃取參數為提取時間20 min，循環2次，溫度100℃，分別在不同壓力(80、90、100、110、120 bar)下，制備豬苓多糖、茯苓多糖萃取液，步驟同1.3.3（1）。

（3）PSE萃取時間對2種食藥用真菌多糖的影響。按1.3.3（1）取樣，操作，PSE萃取參數為壓力90 bar，循環2次，溫度100℃，分別在不同萃取時間(5、10、20、30 min)，制備豬苓多糖、茯苓多糖萃取液，步驟同1.3.3（1）。

（4）PSE循環次數對2種食藥用真菌多糖的影響。按1.3.3（1）取樣，處理，PSE萃取參數為壓力100 bar，時間30 min，溫度110℃，根據不同的循環次數（1、2、3、4次）制備豬苓多糖、茯苓多糖萃取液，步驟同1.3.3（1）。

1.3.4 正交實驗 根據單因素實驗的篩選結果，選擇并設計L9(34)正交實驗的影響因素，PSE提取豬苓多糖和茯苓多糖的因素水平表見表1。

表1 L9(34)正交實驗因素水平表

1.3.5 驗證實驗 根據篩選結果，在最佳提取條件下提取豬苓多糖和茯苓多糖，并與熱回流提取法進行對比分析。

2 結果與分析

2.1 線性關系考察結果

經分析測定，葡萄糖對照品線性方程為Y=7.6030X-0.0157（r=0.9996，線性范圍0.02～0.10 mg/mL）。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 PSE萃取溫度對2種食藥用真菌多糖的影響結果 由圖1可以看出，在一定萃取溫度范圍內，2種食藥用真菌多糖含量與PSE萃取溫度具有正相關性。盡管萃取溫度能夠顯著影響多糖的提取率，但當溫度增至一定程度時，豬苓多糖和茯苓多糖含量的增加并不顯著，甚至可能使多糖在高溫下發生降解。因此，本實驗測定2種食藥用真菌多糖含量選擇PSE的最佳萃取溫度為110℃。

圖1 不同PSE萃取溫度對2種食藥用真菌多糖含量的影響

2.2.2 PSE萃取壓力對2種食藥用真菌多糖的影響結果由圖2可以看出，在一定壓力范圍內，PSE萃取壓力與2種食藥用真菌多糖含量的關系趨勢均為先增加后降低，萃取壓力增高有利于多糖的溶出，但萃取壓力過高，則可能會促進多糖的分解。因此，本實驗測定豬苓多糖含量時選擇PSE的最佳萃取壓力為100 bar，測定茯苓多糖含量時選擇PSE的最佳萃取壓力為110 bar。

圖2 不同PSE萃取壓力對2種食藥用真菌多糖含量的影響

2.2.3 PSE萃取時間對2種食藥用真菌多糖的影響結果 由圖3可知，2種食藥用真菌多糖的含量均隨著PSE萃取時間的增長而增加，兩者呈正相關性。盡管萃取時間能夠顯著影響多糖的溶出，但在一定萃取時間內，多糖的溶出會達到平衡，因而持續增加PSE的萃取時間并不能使2種食藥用真菌多糖的提取率顯著增長。本實驗測定豬苓多糖含量時選擇PSE最佳萃取時間為20 min，測定茯苓多糖含量時選擇PSE最佳萃取時間為25 min。

圖3 不同PSE萃取時間對2種食藥用真菌多糖含量的影響

2.2.4 PSE循環次數的篩選結果 由圖4可知，PSE循環次數對2種食藥用真菌多糖的含量增長影響并不明顯，循環次數并不是影響對豬苓多糖和茯苓多糖含量的主要因素，若多次循環萃取，高溫、高壓、長時間萃取還可能導致多糖的降解。根據實際操作情況設定PSE循環次數為2次。

圖4 不同PSE循環次數對2種食藥用真菌多糖含量的影響

2.3 正交實驗結果

根據正交實驗表2結果及表3的方差分析可知，PSE萃取豬苓多糖的最佳工藝條件為A3B2C2，PSE溫度影響極顯著、時間影響顯著、壓力影響不顯著。PSE萃取茯苓多糖的最佳工藝條件為A3B3C3，PSE溫度影響顯著、時間和壓力影響不顯著。盡管PSE萃取溫度能顯著影響2種食藥用真菌多糖的含量，PSE萃取時間能顯著影響豬苓多糖的含量，但考慮到持續增加提取溫度和延長提取時間可能導致多糖的降解，最終確定豬苓多糖最佳PSE提取條件為萃取溫度110℃，萃取壓力110 bar，萃取時間20 min，循環2次；茯苓多糖最佳PSE提取條件為萃取溫度110℃，萃取壓力120 bar，萃取時間25 min，循環2次。

表2 正交實驗結果

表3 方差分析

2.4 驗證實驗結果

由表4結果可知，采用PSE提取工藝提取2種食藥用真菌多糖，其提取率與傳統熱水提取法相比有顯著提高，從而驗證了篩選結果的準確性。

表4 提取方法比較結果(n=3) mg/g

3 結論

筆者以食藥用真菌豬苓和茯苓為研究對象，旨在借助PSE萃取技術的高溫、高壓、高效等特點，改善常見的多糖提取方法存在的提取時間長、提取效率低等弊端[32]，以便高效提取2種食藥用真菌多糖成分，并采用單因素及正交實驗優選了PSE法提取多糖的最佳工藝條件。研究結果表明，采用PSE法提取豬苓多糖成分的最佳工藝條件為萃取溫度110℃，萃取壓力110 bar，萃取時間20 min，循環2次；采用PSE法提取茯苓多糖成分的最佳工藝條件為萃取溫度110℃，萃取壓力120 bar，萃取時間25 min，循環2次。上述結果表明，PSE萃取法提取2種食藥用真菌多糖與傳統的提取方法相比2種多糖含量有顯著提高。

4 討論

食品活性成分檢測需要運用快速、靈敏的分析技術。PSE法作為一種快速前處理技術在很多食品分析中進行了應用，Rizwan等[36]采用PSE法提取食品級辣椒果實中的酚類化合物，結果發現，不同萃取溶劑及萃取溫度對酚類化合物的提取率影響顯著；Niyaz等[37]采用PSE法提取茶和咖啡中的甲基黃嘌呤，發現萃取溫度及萃取溶劑對甲基黃嘌呤的提取率影響顯著。盡管PSE技術的應用開展較為廣泛，但其在多糖樣品提取中的應用并不多見，其中王宇晴等[38]采用PSE法提取靈芝多糖，結果發現，萃取溫度及萃取時間對靈芝多糖的提取率影響顯著。因此，筆者在前期工作的基礎上，將PSE法系統應用于豬苓多糖和茯苓多糖的提取，結果表明，萃取溫度及萃取時間對豬苓多糖及茯苓多糖的提取率影響較為顯著，考慮到持續增加提取溫度和延長提取時間可能導致多糖的降解，筆者優選PSE法提取多糖的最佳工藝條件，從而充分證明了PSE法適用于食藥用真菌多糖的快速提取，為食藥用真菌多糖的提取提供了一種新方法，也為PSE法的廣泛應用提供了參考。