基于高通量測序方法的蒙古櫟SSR標記開發

陳 罡，于世河，姜義仁，卜鵬圖，鄭 穎，馮 健

（1遼寧省林業科學研究院，沈陽 110032；2沈陽農業大學生物科學技術學院，沈陽 110866）

0 引言

蒙古櫟(Quercus mongolica)為殼斗科櫟屬植物，主要分布于中國的華北、東北，朝鮮半島，俄羅斯遠東和蒙古等地。蒙古櫟是國內東北和華北地區針闊葉混交林的主要建群種，在維持地域生態平衡和生態系統恢復重建中有重要的作用，因此具有重要的生態價值和經濟價值[1]。有關蒙古櫟種內遺傳變異的研究相對較少[2]，為育種、造林和基因資源保存，有必要對現有的蒙古櫟天然林、天然次生林進行分子水平的遺傳多樣性研究[3]。

SSR標記是一種比較理想的共顯性分子標記，具有基因組中廣泛存在、特異性強、多態性高、實驗重復性好、結果穩定可靠等優點，被廣泛應用于林木遺傳改良、遺傳圖譜構建、分子標記輔助育種、遺傳多樣性研究、親緣關系分析、種質資源保存、QTL作圖等許多應用研究領域[4]。目前，對部分地區的蒙古櫟群體遺傳多樣性研究大都利用RAPD標記、等位酶技術、AFLP技術及ISSR標記等顯性分子標記技術[5-8]，可供利用的專門針對蒙古櫟開發的SSR標記較少[9-11]，因此需要更多的SSR標記的開發進行補充，以增加位點數[12]。目前尚未見到利用二代基因組測序技術開發蒙古櫟SSR位點的報道。本研究基于中國分布蒙古櫟基因組de novo拼接的二代測序數據，旨在發掘一批擴增效率高、多態性好的引物，為進一步開展蒙古櫟遺傳資源評價、種質資源多樣性分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年6月下旬采集遼寧8個不同地區的蒙古櫟葉片，硅膠干燥保存備用。用于二代測序建庫的樣本群體為DA（采自撫順大孤家），用于引物驗證的8個樣本信息見表1。

表1 樣本采樣信息

1.2 基因組DNA提取與建庫測序

采用CTAB法提取基因組DNA[13]，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA大小和完整性。利用NanoDrop ND-2000分光光度計（Thermo Fish Scientific公司）分析DNA純度和濃度，隨后用1×TE緩沖液稀釋基因組DNA至終濃度為20 ng/μL，-20℃保存備用。

DNA打斷，末端補平，3'端加A，連接測序接頭，文庫構建并質檢，構建合格的文庫利用Illumina HiSeq2500平臺進行雙末端測序。實驗由北京閱微基因技術有限公司完成。

1.3 生物信息學分析

原始數據以FASTQ格式進行保存，用Trimmomatic軟件[14]進行數據過濾，去除reads中包含的測序接頭序列、低質量序列、重復reads、含N（N表示無法確定堿基信息）的序列，最后得到干凈序列(clean reads)。用Flash軟件進行無參考基因組的de novo拼接[15]，默認參數設置。

1.4 基因組SSR位點開發與引物設計

利用MISA軟件[16]對拼接好的序列片段進行SSR位點搜索和鑒定，MISA軟件能識別出序列中的單核苷酸SSR和復合SSR及所在的位點，查找參數設為二、三、四、五核苷酸最小重復次數為6、5、5、5次。用Primer3對含有SSR位點且側翼適合設計引物的序列進行引物設計。將設計的引物與前人已開發的SSR引物進行比對，去除重復位點。

1.5 引物篩選與PCR擴增

PCR 反應體系為 10 μL：10×Buffer I 1.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，帶有M13序列的熒光引物TP-M13(5 μmol/L)0.5 μL（HEX 或 FAM 熒光），特異SSR 引 物 (5 μmol/L)0.6 μL，Takara HS Taq（ 大 連TaKaRa生物）0.1 μL，DNA模板1.2 μL，ddH2O 5.8 μL。

按以下程序在GeneAmp 9700上（Applied Biosystems公司）完成PCR擴增。95℃在PCR儀上進行預熱5 min；然后94℃模板變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，程序重復30次循環；隨后94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸擴增30 s，重復10個循環；最后60℃持續30 min。向96孔板中每孔加入分子量內標GS500 LIZ（Applied Biosystems公司）和甲酰胺混合液(0.5:8.5)9 μL，PCR產物1.0 μL，95℃變性3 min。帶有不同熒光PCR擴增產物上ABI 3730XL測序儀進行檢測。將檢測得到的原始數據“.fsa”文件導入到分析軟件GeneMapper 3.2（Applied Biosystems公司）中進行自動分析，手工校正。多色熒光引物合成和檢測均由北京閱微基因技術有限公司完成。用Popgene32軟件計算遺傳距離(Nei)[17]。

2 結果與分析

2.1 蒙古櫟SSR位點開發

共測得2.6 G的數據量，獲得原始reads 8956795對，用Flash軟件拼接后獲得4876401條序列。MISA軟件對拼接后的序列進行掃描，搜索鑒定SSR位點，共在282605條序列鑒定出SSR基元，占拼接序列總數的5.8%。選擇含有SSR位點的序列，利用Primer3批量設計引物，設計引物參數為GC含量40%～60%，退火溫度Tm為50～60℃，引物長度18～25 bp，目的片段預期100 bp以上，符合引物設計條件的序列148479條，占含SSR重復基元序列數的52.5%。這些序列構成了后續進行大規模SSR引物開發的序列基礎。

2.2 蒙古櫟SSR引物的確定

作為初步研究，隨機挑選合成40對引物進行篩選和驗證，最終篩選出10對重復性好的SSR引物（表2），其中7個位點的重復基元為3核苷酸重復，4核苷酸重復位點有3個。從重復基元的類型看，位點N1014482和N4544558重復核苷酸類型是一樣的(AAT)，位點N1010265和N1110207是CAA重復，位點N1105306和N4529840的重復類型是相同的(TTC)，其余4個位點的重復基元序列均不同。

2.3 毛細管電泳熒光檢測

為驗證這些引物是否在群體中具有多態性，利用采自遼寧不同地區的8個蒙古櫟樣本進行擴增驗證。圖1所示為引物對N1010265的熒光擴增產物在自動測序儀上的條帶大小，模板分別來自采集的8個地區樣本，橫坐標為擴增的片段大小，縱坐標為擴增產物的熒光強度。從圖中可以看出，總體信號清晰，8個DNA樣品的電泳峰型各異，呈現出較好的多態性。統計結果表明，這10個SSR位點均為多態性位點（表2），等位基因數最高的是N1457047位點，達到6個。總體上，片段大小范圍為135～215 bp，片段最長的位點是N4529840，為200～215 bp；片段最短的是N1345390和N12361位點，擴增長度分別為135～153、139～152 bp。

圖1 利用引物N1010265對8個樣品擴增的峰值圖

表2 蒙古櫟10對SSR引物信息

2.4 新開發SSR標記群體內檢測

為進一步驗證新開發SSR引物的有效性，選用10對引物對采集自撫順大孤家地區的15個蒙古櫟材料進行擴增，結果表明，15個材料的遺傳距離在0.689～0.919之間（表3），說明在同一地區群體內存在一定的遺傳變異，通過計算得出該群體平均等位基因數為4.2個，有效等位基因數為2.7個，Shannon多樣性指數為1.104，從結果可見蒙古櫟群體遺傳多樣性處于較高水平。

表3 15個蒙古櫟材料遺傳距離

3 結論與討論

SSR標記的開發需要預先知道側翼序列信息以設計引物進行PCR擴增，這些序列通常利用一代測序方法獲得，檢測方法也是低通量的聚丙烯酰胺凝膠電泳。因此，傳統的SSR標記開發引物通常都涉及一系列繁復的基因組建庫、重復片段富集、雜交、多個克隆篩選和桑格測序等操作步驟[18]，效率較低成本較高，使得SSR標記僅在模式植物或者是經濟價值較高的植物上得到開發和應用[19]。隨著新一代測序技術帶來的高通量優勢，測序效率大大提高，對物種的基因組和轉錄組進行大規模測序和細致分析成為簡單易行的方法，給SSR標記的開發也帶來了很大便利[20-21]；另一方面，隨著多色熒光標記檢測技術的廣泛應用，SSR片段的記錄和分析可以實現自動化，檢測效率、準確率和重復性得到明顯改進[22]。本研究利用高通量測序技術，在較短時間內開發了10對蒙古櫟專屬SSR引物，對SSR新位點多態性驗證表明，每個位點的等位基因數為4～6，平均為4.5個，且均具有較好多態性，這將為下一步分析遼寧地區分布的蒙古櫟群體遺傳多樣性和遺傳改良提供技術基礎。

鑒于SSR標記的優點，研究人員十分關注SSR標記引物的開發。就SSR引物的來源看，一種是來源于近緣物種間的通用性引物，這種方法雖然方便、快捷、經濟，但是存在很大的物種局限性，原物種的SSR基因位點在其他物種間轉移擴增時，存在未知性和同源性問題，盲目性較大。另一種則是基于各種方法開發物種特有SSR位點。開發特有SSR標記的方法各具優勢，常用方法如基于ISSR-PCR開發SSR標記、基于EST序列開發SSR標記等，本研究是基于基因組de novo拼接序列數據開發SSR標記，鑒定的10個SSR位點中，三基元的占了70%，其中CAA基元和TTC基元相對占比較高，與前人開發的櫟屬SSR標記特征有所不同[23-25]，這可能與此次統計的SSR位點相對較少，且在引物設計時剔除了復合型和非完全型的SSR位點有關，將在今后蒙古櫟SSR標記開發中做進一步研究。