云南藍莓根癌病病原鑒定及其防控藥劑的篩選

張榮琴，萬效琰，張晉豪，代真林，鄭建立，崔興國，趙項武，魏蘭芳，姬廣海

（1云南農業大學/農業生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室，昆明 650201；2云南省紅河熱帶農業科學研究所，云南河口 661300；3曲靖佳沃現代農業有限公司，云南曲靖 655000）

0 引言

藍莓(Vaccinium spp.)又稱越桔，屬杜鵑花科越桔屬灌木，分布在熱帶、亞熱帶、溫帶等地區。藍莓果實風味獨特，營養豐富，具有較高的經濟價值和廣闊的栽培前景[1]。近年來，藍莓在云南省的種植面積逐年增加，各種藍莓病害也頻繁發生[2]，其中藍莓根癌病是一種為害藍莓根部的重要病害，使藍莓產量急劇下降，經濟損失嚴重。根癌病是一種普遍發生的細菌性病害，由具有致瘤性的根瘤菌科菌株引起，包括土壤桿菌屬、異根瘤菌屬和根瘤菌屬的多個種，可侵染多種果樹和一些多年生觀賞植物[3]，危害根頸、主根、側根[4]，為果園及苗圃帶來重大經濟損失。2010年，阿根廷首次發現和報道了由根癌農桿菌引起的藍莓根癌病[5]，同年國內研究人員在遼寧、吉林、山東及黑龍江省發現了藍莓根癌病[6]，目前未見云南省藍莓根癌病的研究報道。為闡明云南省發生的藍莓根癌病病原菌種類，筆者采用多點采樣，進行病原菌分離培養、致病性測定和病原菌的系統鑒定，以期為藍莓根癌病的研究和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

藍莓根癌病樣品分別采集自云南省藍莓主栽區曲靖市麒麟區、馬龍區，玉溪市澄江縣，昆明市石林縣藍莓基地發病地塊。采集具有根癌病病癥的根部腫瘤組織，保存于紙質采樣袋中。

1.2 菌株分離和培養

參照文獻[7-8]中根癌菌的分離方法。選取根部腫瘤組織白色幼嫩部分，清洗干凈后用75%乙醇表面消毒60 s，再用無菌水漂洗3次，用無菌研缽將組織研碎，轉移至無菌三角瓶中，加入45 mL無菌水，28℃160 r/min振蕩30 min，將上清液梯度稀釋(10-1～10-5)，各取100 μL在YEM和MW培養基按低濃度至高濃度進行涂布分離，28℃培養48 h。參考文獻[9]中根癌土壤桿菌代表菌株的菌落特征和生物學特性測定方法，篩選具有根癌土壤桿菌特征的單菌落，純化培養2代后保存備用（表1）。

表1 藍莓根部腫瘤中分離獲得的菌株

1.3 致病性測定

1.3.1 向日葵、番茄接種試驗 選取向日葵和番茄為指示植物[10]。將分離得到的20株純培養菌株（表1）分別接種到50 mL KB液體培養基中，28℃過夜培養，制備濃度為1×109CFU/mL的菌懸液。采用針刺法接種健康向日葵和番茄植株的莖基部并用脫脂棉保濕，對照用無菌水接種處理，每個處理5個重復。每天觀察植株發病情況，2周后開始觀察并記錄腫瘤的生長情況。根據柯赫氏法則對發病部位進行再分離，根據菌株的形態特征判斷分離得到的病菌是否與原接種菌株相同。

1.3.2 藍莓回接試驗 選取致病性較強的菌株回接藍莓。菌懸液制備方法同1.3.1，灌根生長健壯的藍莓植株，對照用無菌水灌根處理，每個處理5個重復。每天觀察植株發病情況，30天后開始觀察記錄腫瘤的生長情況。

1.4 病原菌的分子生物學鑒定

1.4.1 病原菌DNA的提取 將供試菌株L-11、2JK11（芽孢桿菌）、1-BT-186（假單胞菌）、1-BT-22（冬青節桿菌）、2-BT-19（黃桿菌）、RG-4（根瘤菌）接種至NA培養基，28℃培養24 h，用接種環挑取少量菌體接種于LB液體培養基，28℃160 r/min過夜培養后收集菌體。按照細菌DNA提取試劑盒（天根DP302-02）說明書提取細菌基因組DNA。

1.4.2 16S rDNA序列分析及其同源性比較 根據已發表的細菌16S rDNA通用引物[11]27F和1492R對供試菌株進行PCR擴增，引物序列為27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3’)/1492R(5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。 參 照 Taq PCR Master Mix（catTSE030，擎科）配制25 μL PCR反應體系，PCR擴增程序為：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環，72℃延伸10 min；擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。擴增產物送上海生工生物工程有限公司進行測序。將得到的16S rDNA序列與BLAST中的分析結果進行比較，使用MEGA6.0構建系統發育進化樹。

1.4.3 特異性引物設計及檢測 將根癌土壤桿菌的ipt基因在BLAST中進行同源性比對并將靶片段序列通過BLASTn進行同源性比對，設計出特異性較強的藍莓根癌病菌特異性引物[12-14]，由昆明擎科生物技術公司合成。引物序列為AtP3F(5’-GCAACGAGTTAGCAGAC GAG-3’)/AtP3R(5’-CCCATCGATCCCTTCCAGTA-3’)，預期片段為155bp。

利用AtP3F/AtP3R對菌株L-11和5株非靶標菌株2JK11、1-BT-186、1-BT-22、2-BT-19、RG-4進行PCR擴增。參照Taq PCR Master Mix（catTSE030，擎科）配制25 μL PCR反應體系，PCR擴增程序同1.4.2，擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.5 Biolog生理生化特性測定

采用美國BIOLOG公司的MicrostationTMV 4.01系統、革蘭氏陰性菌微板(GN)和數據庫，Biolog-GN板反應底物如表2，試驗程序按公司的操作指南進行。將供試菌株L-11在YEM培養基上轉接2次，劃線接種到Bug瓊脂培養基上，28℃培養24 h，用無菌棉簽輕輕擦拭培養基上的菌落，移入無菌稀釋緩沖液中，混勻得到菌懸液，測定其濁度為98%。用移液器將菌懸液加入GN微孔板，每孔150 μL，共96孔，對照孔加150 μL無菌水，置于28℃培養，4、24、48 h后讀數記錄結果。

表2 Biolog GN微孔板上96種碳氮源底物

1.6 田間藥劑篩選

1.6.1 供試藍莓 試驗藍莓園位于曲靖市麒麟區越州鎮大梨樹村，試驗于2018年12月開始、2019年5月結束。

1.6.2 供試藥劑 化學藥劑包括50%氯溴異氰尿酸粉劑（南京南農農藥科技發展有限公司），1.5%噻霉酮水乳劑（陜西西大華特科技實業有限公司），1%申嗪霉素懸浮劑（上海農樂生物制品有限公司），葉斑寧-60億芽孢/mL解淀粉芽孢桿菌Lx-11水劑（江蘇蘇科農化有限公司）。生防菌劑為WR13-6、C3、13-6、枯草芽孢桿菌，均由本實驗室提供。

1.6.3 試驗方法

（1）藥劑施用方法。選擇基地中發病嚴重的藍莓植株進行藥劑試驗，共9個處理（8個藥劑處理，1個空白處理），每個處理30株藍莓，供試藥劑稀釋至相應濃度（表3），每隔10天灌根1次，每株每次灌1000 mL，共灌根5次。

表3 藥劑施用濃度

（2）試驗結果調查及統計方法。

①坐果率調查。花期結束后每隔15天調查1次坐果情況，直至果實子房膨大成形不再出現生理落果為止。

②田間藥劑防效評估。最后一次灌根10天后進行病情調查。每個小區隨機選取5株藍莓進行調查，3次生物學重復，依據根瘤情況進行分級（表4），按照式(2)～(4)計算各處理的發病率、病情指數以及防效。

表4 根癌病分級標準

式中，A為試驗區處理后的病情指數，B為試驗區處理前的病情指數，C為對照區處理后的病情指數，D為對照區處理前的病情指數。

2 結果與分析

2.1 田間癥狀

藍莓根部腫瘤早期呈圓形、黃白色，后期瘤體慢慢變大，并由黃褐色變為暗褐色。根部腫瘤傾向于木質化，表皮粗糙，近圓形或不規則，直徑可達2～3 cm，嚴重可達10～15 cm。田間調查發現，根癌發病早期在苗木根部形成較小的白色或者肉色粗糙瘤狀物（圖1D）。感染根癌病后，植物根部吸收水分及營養物質受阻，根系發育不良；發病后期，植株生長緩慢，葉片變黃、干枯甚至整株死亡[12]。

圖1 田間藍莓發病癥狀

2.2 致病性測定

2.2.1 向日葵、番茄接種試驗 20株供試菌株接種向日葵幼苗2周后，接種P2-2、L-3、L-11、L-5的向日葵在莖基部開始出現不規則的瘤狀突起，接種其他菌株的向日葵和對照無瘤狀突起（圖2A）；接種30天后，瘤狀突起逐漸增大形成明顯腫瘤，接種L-11的植株瘤狀突起最大，其余16株菌株和對照仍無瘤狀突起。L-11接種番茄幼苗14天后，接種部位出現瘤狀突起（圖2B）。從接種發病部位重新分離病原菌獲得純培養物，通過菌株形態學特征判斷分離得到的病菌與原接種菌株相同。

圖2 L-11致病性檢測

2.2.2 藍莓植株回接試驗 L-11灌根藍莓60天后，在接種植株根部形成不規則的結節狀突起，對照植株的接種部位無瘤狀突起。90天后瘤狀突起逐漸增大，形成明顯的冠癭瘤（圖3B），對照植株無腫瘤形成（圖3A）。

圖3 L-11接種藍莓幼苗的癥狀

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 Biolog生理生化鑒定 將L-11菌懸液接種到Biolog革蘭氏陰性菌微孔板(GN)中，4、24、48 h后分別測定其對碳、氮源的利用情況并與數據庫中的標準菌株進行比較。L-11與數據庫中的放射根瘤菌/土壤桿菌屬(Rhizobium radiobacter/Agrobacetrum sp.)相似程度較高（表5），碳源、氮源利用情況完全相同，均不能利用亞甲基丁二酸(E2)、α-氧代戊酸(E5)、D-絲氨酸(G8)。

表5 L-11菌株在Biolog GN微板中的代謝活性195 mm×132 mm(96×96 dpi)

2.3.2 分子生物學鑒定

（1）16S rDNA分子鑒定。以L-11基因組DNA為模板，用16S rDNA通用引物27F/1492R進行PCR擴增，擴增產物約1500 bp。L-11 16S rDNA測序序列（登錄號MK910214.1）進行BLAST比對,與根癌土壤桿菌Agrobacterium tumefaciens Ell-7序列（登錄號FJ613554.1）相似度達到97.65%；將L-11的16S rDNA序列與其他農桿菌屬的序列進行比較并構建系統發育樹（圖4），表明L-11與標準菌株Ell-7親緣關系最近。因此，云南省藍莓根癌病的病原菌鑒定為根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)。

圖4 基于16S rDNA序列的藍莓根癌病原菌相關種系統發育樹

（2）特異性引物擴增結果（圖5）。利用根癌土壤桿菌特異性引物AtP3F/AtP3R，對L-11、2JK11、1-BT-186、1-BT-22、2-BT-19、RG-4基因組DNA進行PCR擴增。L-11擴增出155 bp的特異性片段，其他菌株均未擴增出條帶，可將L-11鑒定為根癌土壤桿菌。

圖5 特異性引物AtP3F/AtP3R擴增產物凝膠電泳圖譜

2.4 田間藥劑篩選

藥劑篩選結果（表6）表明，1.5%噻霉酮水乳劑防治效果最好(52%)，1%申嗪霉素懸浮劑、C3生防菌劑、50%氯溴異氰尿酸粉劑防治效果次之，分別為48%、45%、43%。

表6 藍莓根癌病田間藥劑試驗防治結果

3 結論

本研究對云南省藍莓主產區采集的藍莓根癌病樣品進行病原菌的分離培養，通過致病性測定和多種分類鑒定方法，證實云南發生的藍莓根癌病是由根癌土壤桿菌所致，并篩選出對藍莓根癌病有較好防治效果的藥劑1.5%噻霉酮水乳劑，為進一步開展有關該病發病規律及防治技術的系統研究提供科學依據。

4 討論

根癌病菌可侵染93科331屬643種植物，包括多種果樹、林木、花卉甚至瓜類，造成嚴重的經濟損失[15]。根癌病病原菌較多，包括土壤桿菌屬、異根瘤菌屬和根瘤菌屬的多個種[2]。土壤桿菌屬和根瘤菌屬的關系一直存在爭議。有學者提出按照16S rDNA序列分析可將土壤桿菌屬(Agrobacterium)和異根瘤菌屬(Allorhizobium)歸為根瘤菌屬(Rhizobium)[16]，但也有學者發現根瘤菌屬(Rhizobium)中個別種與土壤桿菌屬的關系不是很密切，不能籠統地說土壤桿菌和根瘤菌的關系較近，而應該深入研究土壤桿菌與根瘤菌的種間關系[17]。土壤桿菌屬與根瘤菌屬的鑒別標準之一是病菌引起致病癥狀還是引起根瘤[18]。本研究分離得到的菌株P2-2、L-3、L-11、L-5都會引起藍莓根部腫瘤，說明這4株菌歸類至土壤桿菌屬。

根癌病菌通過傷口侵染植物，T-DNA在寄主植物中表達，編碼生長素和細胞分裂素的生物合成，使植物細胞增殖失控，導致腫瘤的形成[19]?；瘜W農藥防治效果并不顯著，持效性差[20]，1.5%噻霉酮水乳劑防治效果較好但相對防效也僅為52%。目前生物防治研究發展較快，R.rhizogenes K84（商品名根癌寧）可有效防治桃根癌病[21]。K84是Kerr于1972年發現的一株無致瘤性的發根根瘤菌[22]，主要作用方式是接合質粒pAgK84編碼產生土壤桿菌素84進而殺滅細菌[23]。另外放射土壤桿菌M I-15也能有效抑制葡萄根癌菌的生長和致瘤[24]。還有無致病性的葡萄土壤桿菌E26菌株對葡萄根癌病具有良好防效[25]。目前生產上可在施用藥劑的同時，采用植物檢疫，苗木、砧木消毒，及時清除田間病株，選育抗病品種，改進嫁接方式等手段進行綜合治理，控制藍莓根癌病的發生，以實現藍莓產業的可持續發展。