水稻-油菜周年耕作方式對土壤微生態的影響

高杜娟，劉興錄，蘭志斌，趙 楊，陳友德，周 斌，呂艷梅，羅先富，唐善軍

（1湖南省水稻研究所/農業部長江中下游秈稻遺傳育種重點實驗室，長沙 410125；2安仁縣農業科學研究所，湖南郴州 423600）

0 引言

由于多種自然和社會經濟因素的限制，近年來湘北洞庭湖區調整為以水稻-油菜輪作為主的種植模式，這種模式具有充分利用光熱資源、季節矛盾小等優點[1-2]。免耕栽培作為一種保護性耕作措施，是目前發展可持續農業的主要技術之一，具有降低勞動力投入和減少水土流失的特點，在國內外得到廣泛實施[3-5]。因此，研究稻-油系統周年不同耕作方式對土壤微生態的影響，對合理耕作方式的選擇具有重要的現實意義。土壤微生物作為土壤生命的體現者，在有機質的分解和土壤養分轉化過程中發揮作用[6]，是維持土壤質量的重要組成部分[7]，它與土地利用方式[6-8]、土壤類型[9]、植被和氣候等密切相關[8-10]。土壤微生物群落的多樣性是生態系統多功能性的關鍵因子，研究發現，微生物與農田生態密切相關[11]。在水稻農田系統發現，在產量越好的情況下，作物植被根系釋放更多滲濾液[12-13]，有利于微生物量的增加[14]。傳統的旋耕會破壞土壤結構，造成侵蝕和養分損失，降低土壤的功能潛力[15]。而長期免耕有助于增加土壤微生物群落的大小[16]，也有助于提高土壤酶活性[17]。但免耕栽培與傳統旋耕方式相比，對稻-油水旱輪作系統土壤微生物數量及功能、土壤酶活性的影響，不同學者得出的結論不盡相同。土壤宏基因組測序方法能夠更全面地分析土壤中微生物的物種及基因等方面的多樣性，也可以深入分析特殊功能基因的豐度，是一種研究土壤微生態的好方法。因此，本研究設置稻-油系統不同耕作方式，評價耕作方式對土壤微生物總量、土壤生理類群微生物數量、群落結構和土壤酶活性的影響，探討不同耕作方式對土壤微生態的影響，以期為合理耕作方式的選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試土壤采自湖南益陽三仙湖鎮太平橋村，其基本理化性質為pH 8.0、有機質4.1 g/kg、堿解氮202.15 mg/kg、有效磷11.51 mg/kg、速效鉀80.12 mg/kg。

1.2 試驗設計

試驗于2016年1月—2019年5月展開，試驗地點經過10年以上免耕栽培。試驗采用大區設計，大區面積282 m2(47 m×6 m)，大區進行開溝分廂，每個廂面寬1.8 m，溝的尺寸均為寬30 cm、深20 cm。試驗設置2種耕作方式，均為一季水稻+油菜周年輪作，處理1開展水稻和油菜的雙免耕雙直播(DNT)，處理2開展水稻旋耕拋秧的雙季旋耕(DT)，油菜旋耕移栽，其他水肥管理措施同樣進行。在水稻收獲期，將每個大區分3個小區以五點取樣法取樣，除去土壤表層的植物殘體后，采集0～5 cm的土樣混合，用鑷子除去土樣中的植物根系、殘渣及石頭等雜物，土樣用無菌袋收集后帶回實驗室分為3份，一份樣品分裝至無菌EP管中，液氮速凍后干冰運輸至測序公司；一份樣品風干后，用于土壤酶活性測定；一份樣品4℃保存，用于土壤微生物測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤酶活性測定 脲酶活性測定采用苯酚鈉比色法[18]；磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法測定[19]；轉化酶和纖維素酶活性測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法[8,20]；過氧化氫酶活性測定采用高錳酸鉀滴定法[21]。

1.3.2 可培養土壤微生物數量測定 將風干土壤樣品按十倍稀釋法稀釋后，取稀釋液分別加入馬丁氏培養基（真菌）、牛肉膏培養基（細菌）和改良高氏1號培養基（放線菌）中，涂板后倒置在培養箱中培養，計算被測樣品的菌落數。細菌或放線菌以每皿30～300個菌落為宜，真菌以每皿10～100個菌落為宜。氨化細菌、反硝化細菌、硝化細菌測定采用MPN法。

1.3.3 土壤微生物宏基因組測序 將土壤樣品提取基因組DNA，電泳定量后以擴增區域V3～V4（細菌）和ITS1～ITS2（真菌）進行靶定區域擴增，擴增后的樣品進行定量混合，對混合后的樣品進行高通量測序，測序儀為Illumina MISEQ03。對測序結果進行數據處理及統計，完成序列拼接、過濾和去嵌合后，進行OUT聚類分析、Alpha多樣性分析、物種分類分析和菌群差異分析。

1.4 數據處理

試驗數據采用Microsoft Office Excel 2007和DPS 7.5進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 不同耕作方式的微生物群落組成

將OUT代表序列與數據庫比對后，在各水平統計各樣品的群落組成，計算不同耕作方式的土壤文庫所含物種類群的百分比組成，只展示豐度水平前10位的物種。

2.1.1 細菌群落組成 如圖1所示，免耕直播和旋耕拋栽土壤中的優勢類群均為Proteobacteria和Acidobacteria，兩者在不同耕作方式的土壤中的相對豐度均超過60%，在免耕土壤中為66.87%，在旋耕土壤中為67.79%。2種耕作方式土壤豐度水平前10位的物種在門水平相同，但微生物種群豐度在不同耕作方式間所不同。雙免耕雙直播處理下的Acidobacteria、Planctomycetes、Bacteroidetes和 Verrucomicrobia的相對豐度高于旋耕拋栽，土壤中Proteobacteria、Nitrospirae、 Gemmatimonadetes、 Latescibacteria 和Chloroflexi的相對豐度低于旋耕拋栽。在種水平分析，2種耕作方式土壤豐度水平前10位的物種在種水平也相同，說明2種耕作方式下土壤中細菌群落組成相似。

圖1 不同耕作方式土壤細菌物種相對豐度分布

2.1.2 真菌群落組成 如圖2所示，土壤真菌的測序結果表明未確定分類地位的微生物較多，其結果不能完全反映土壤真菌的真實情況，而且在雙免耕雙直播土壤中未確定分類地位微生物的豐度明顯高于旋耕拋栽。2種不同耕作方式土壤中均是Ascomycota和Basidiomycota這2類真菌的相對豐度較高。其中Ascomycota的相對豐度均超過15%，在免耕土壤中為15.71%，在旋耕土壤中為18.22%。Basidiomycota的相對豐度在不同耕作方式下也有明顯不同，在旋耕土壤中達到5.97%，而在免耕土壤中僅占1.60%。雙免耕雙直播特有的門為Chytridiomycota，旋耕拋栽特有的門為Glomeromycota。在種水平分析，結果表明，2種耕作方式共有的種有5個，分別為Nigrospora oryzae、Pyrenochaetopsis leptospora、 Olpidium brassicae、Itersonilia perplexans和Mortierella alpina。豐度前10的種中，雙免耕雙直播特有的種為Preussia terricola，旋耕拋栽特有的種為Coprinopsis pachyderma和Zopfiella marina。耕作方式對土壤真菌的影響要大于土壤細菌，不僅影響其豐度水平，還會影響其優勢種群。

圖2 不同耕作方式土壤真菌物種相對豐度分布

2.2 不同耕作方式的微生物多樣性比較

表1 中，土壤微生物多樣性指數文庫庫容值在0.96～1.00范圍內，表明所建立的文庫能比較完整地反映土壤中的微生物群落結構。不同耕作方式土壤中的微生物多樣性指數存在較大差異，從反映群落分布豐度的Chao指數來看，雙免耕雙直播土壤中細菌和真菌的豐度高于旋耕拋栽，OUT數目也是雙免耕雙直播土壤中較多，說明雙免耕雙直播土壤中微生物群落豐富度高，微生物種類較多。從反映群落分布多樣性的Shannon指數來看，雙免耕雙直播土壤中細菌群落的多樣性高于旋耕拋栽土壤，而真菌群落多樣性則低于旋耕處理。

表1 土壤樣品的群落多樣性結構指數

2.3 耕作方式對氧需求的響應

利用BugBase軟件對土壤宏基因組測序數據進行微生物群落表型分類，本研究僅分析其在氧需求功能上的差異。從需氧、厭氧和兼性厭氧3個方面來分析，結果（圖3）表明稻-油雙免耕需氧原核微生物群落的相對豐度高于旋耕模式，Acidobacteria、Bacteroidetes、Planctomycetes和Proteobacteria是免耕模式中需氧較多的微生物群落；厭氧的原核微生物群落的相對豐度低于旋耕模式，但Planctomycetes在免耕模式下的群落豐度要高于旋耕；兼性厭氧原核微生物群落主要為Proteobacteria，且雙免耕模式下的兼性厭氧微生物群落豐度要高于旋耕。一般意義上認為，土壤免耕會造成土壤板結、通氣不良的狀況，本研究在稻-油周年耕作試驗中的結果顯示，免耕耕作方式中土壤原核需氧原核微生物的豐度反而要高于旋耕模式，可能說明稻-油周年免耕生產是一種合理耕作方式，不影響土壤的通氣狀況。

圖3 不同氧需求的微生物相對豐度比較

2.4 耕作方式對土壤微生物碳、氮代謝的影響

碳氮代謝是土壤中的2個重要代謝過程，土壤微生物活動需要充足的碳源和氮源，碳和氮是決定微生物活性強弱的關鍵。土壤微生物代謝活動產生的N2O和CH4不僅造成碳氮的損失，還是大氣中溫室氣體的主要排放源。對稻-油周年不同耕作方式的土壤微生物基于FAPROTAX數據庫預測原核微生物菌群的功能，預測出14種功能在2種耕作方式間存在顯著差異(P＜0.05)，其中與氮代謝相關的8種，與碳代謝相關的7種（圖4）。

圖4 碳氮代謝功能相關的原核微生物相對豐度

在氮代謝相關功能中，稻-油雙免耕模式下，涉及硝化作用過程和相關限速步驟的亞硝酸鹽氧化、好氧氨氧化和硝化作用的原核微生物豐度較高，說明免耕模式下，土壤微生物將NH4+-N轉化為NO3--N和NO2--N的能力強；與固氮和氮氣呼吸相關的原核微生物豐度較高，說明免耕土壤有利于N2轉化為NH4+；與反硝化作用過程相關的硝酸鹽呼吸的兼性厭氧原核微生物豐度也較高。旋耕模式中亞硝酸鹽呼吸功能相關的原核微生物豐度要遠高于免耕模式，說明耕作利于土壤中NO2--N轉化為N2。總的來看，原核微生物與氮代謝相關的功能分析表明，稻-油免耕模式利于土壤微生物對氮的利用，利于將無機態氮轉化為有機態氮供作物生長利用。同時，免耕土壤中能進行硝酸鹽呼吸的兼性厭氧的反硝化細菌豐度較高，造成一定程度氮素的損失。稻-油旋耕易于造成氮的損失，利于溫室氣體N2的排放。

在碳代謝相關功能中，免耕模式下，甲醇氧化、芳香族化合物降解功能相關的原核微生物相對豐度較高。旋耕模式中，產甲烷、甲基營養、甲烷營養型、碳氫化合物降解，纖維素水解作用功能相關的原核微生物相對豐度較高。總的來看，稻-油周年旋耕模式中，與產甲烷相關的產甲烷菌和利用甲烷作為碳源的甲烷氧化菌等原核微生物豐度較高，反映其土壤生態系統中甲烷比免耕模式含量高；碳氫化合物降解、纖維素水解作用功能相關的原核微生物相對豐度較高，說明稻-油周年旋耕有利于碳的循環和利用。

2.5 不同耕作方式對土壤酶活性的影響

土壤酶活性既包括已積累于土壤中的酶活性，也包括正在增殖的微生物向土壤釋放的酶活性，與土壤中各種營養元素的釋放與儲存、土壤中腐殖質的形成和土壤的健康狀況息息相關。脲酶是反映土壤無機氮供應能力的一個重要指標，反映有機態氮向有效態氮的轉化能力和土壤無機氮的供應能力。由表2可知，旋耕拋栽會降低土壤中脲酶的活性，雙免耕雙直播比旋耕拋栽土壤中脲酶的活性提高了58.12%。在稻-油系統中，雙免耕雙直播耕作方式下脲酶的活性與旋耕拋栽存在極顯著差異(P＜0.01)。土壤理化性質測定表明，2種耕作方式下堿解氮的含量相當，但雙免耕模式下全氮含量低于拋栽模式，說明雙免耕模式利于提高土壤有效態氮的供應能力。2個結果說明，雙免耕雙直播模式有利于土壤中氮的轉化。

表2 顯示，土壤的轉化酶、磷酸酶和纖維素酶活性在2種耕作方式下存在極顯著差異(P＜0.01)。雙免耕雙直播會降低稻-油系統中土壤轉化酶、磷酸酶和纖維素酶的活性，其活性比旋耕拋栽分別降低了28.57%、11.00%和57.73%。由此可見，免耕直播對土壤纖維素酶的活性影響最大。纖維素酶作為碳循環中的一個重要酶，其在稻-油系統中旋耕拋栽方式下活性高，說明旋耕拋栽有利于土壤中碳的轉化。轉化酶反映土壤有機碳累積和分解轉化規律，其活性在旋耕拋栽模式下較高，也說明旋耕拋栽有利于土壤有機碳的累積。土壤磷酸酶是催化土壤中磷酸單酯和磷酸二酯水解的酶，能將土壤中的有機磷轉化為供植物吸收的無機磷[19-20]，酶活測定結果表明雙免耕雙直播的耕作方式不利于植物對磷的吸收。稻-油系統雙免耕雙直播有利于提高土壤中的脲酶活性，利于土壤中氮的轉化；旋耕拋栽有利于提高土壤中磷酸酶、轉化酶和纖維素酶的活性，對于土壤中磷的利用和碳的轉化有積極作用。

表2 不同耕作方式對土壤酶活性的影響

2.6 不同耕作方式對土壤微生物數量的影響

由表3可知，與傳統旋耕拋栽相比，免耕土壤中可分離培養細菌、真菌和放線菌的數量都較旋耕極顯著降低(P＜0.01)。土壤中氨化細菌和硝化細菌的數量在2種耕作方式中都有極顯著差異(P＜0.01)。在2種耕作方式的土壤中氨化細菌每克土達到了105個，說明在2種土壤中氨化細菌都生長良好，但免耕雙直播條件更利于氨化細菌的生長。氨化細菌能夠將有機物分解產物最終轉變為NH4+，土壤通氣狀況決定其優勢種群，但不影響氨化作用進行。反硝化作用與硝化作用在維持土壤氮的正常循環中扮演著重要的作用，與旋耕拋栽相比，免耕栽培耕作方式中硝化細菌的數量較少，可能是因為硝化細菌是一類好氧菌，免耕耕作不利于其生長；而本試驗不同耕作方式的土壤中反硝化細菌數量相同，說明免耕栽培不影響其生長。可見，免耕栽培耕作方式不利于可分離細菌、真菌和放線菌的生長；不利于氨化細菌和硝化細菌的生長，但是不影響反硝化細菌的數量。

表3 不同耕作方式土壤樣品的微生物計數 個/(g·土)

3 結論

稻-油水旱輪作是洞庭湖區的主要種植模式，雙免耕雙直播的耕作方式能夠增加土壤中氮代謝相關細菌的相對豐度，提高土壤中脲酶活性，因而有利于土壤中氮的轉化和利用；旋耕拋栽的耕作方式能夠增加土壤中真菌的多樣性，提高土壤中磷酸酶、轉化酶、過氧化氫酶和纖維素酶的活性，因而有利于土壤中磷和碳的利用和轉化。本研究結果通過土壤微生物和酶活性的分析，對于指導稻-油水旱輪作下的肥水管理有一定的理論意義。

4 討論

免耕栽培作為一種省時省工、保持水土和節約能源的耕作方式，依靠作物根系和微生物活動創造作物生長的根層土壤結構，為作物的良好生長提供條件。本研究發現，稻-油系統雙免耕雙直播能提高土壤中細菌的多樣性，但是與旋耕拋栽土壤中的細菌群落組成相似。目前的研究也多認為土壤細菌多樣性的增加和土壤免耕措施相關[22-23]，而土壤翻耕更利于真菌主導的微生物群落的生長[24]。雖然免耕管理對土壤健康有一些好處，但長期免耕可能導致微生物減少，并最終導致0～5 cm表面土壤的功能多樣性降低[24-25]。不同耕作方式對真菌群落結構有顯著影響，免耕和翻耕會形成不同特征的真菌區系，免耕秸稈覆蓋的土壤多樣性高于翻耕[26]。本研究發現壺菌門為稻-油系統雙免耕雙直播土壤特有，而球囊菌門僅在翻耕土壤中存在，這一結果證實免耕和翻耕會形成不同特征的真菌區系。免耕通過減少對土壤結構的破壞，對保持水土有積極的生態意義，但同時免耕會造成土壤板結，使土壤透氣性變差，筆者的研究也證實雙免耕雙直播土壤真菌的多樣性低于旋耕拋栽。同時也發現，硝化細菌作為一類好氧菌，在免耕耕作中數量較少。也有研究發現，稻-油水旱輪作后免耕土壤(0～20 cm)微生物數量和生物多樣性都顯著低于常規操作[17]，這與筆者的研究結果有一定差異。而在棉花、大豆等旱地土壤的研究中發現，免耕可以顯著增加土壤微生物群落的大小，對細菌多樣性產生負面影響[27]，這也與本研究結果不同。說明土壤微生物是一個非常復雜的指標，和土壤類型、取樣時期以及取樣深度等都有很大關系。

本研究土壤中變形菌門的相對豐度都達到50%，說明稻-油系統免耕和旋耕對土壤變形菌門的影響不大，變形菌門是細菌中最大的一門，包括很多固氮的細菌，變形菌門的增多有利于土壤氮素的有效轉化[28]。本研究結果還顯示在免耕土壤中涉及固氮功能的細菌豐度要高于旋耕，可能進一步說明其更利于土壤中氮的循環利用。Planctomycetes中有一類與Planctomyces等關系較遠的細菌，為厭氧氨氧化菌，它們能在缺氧環境下利用NO2-和NH4+生成氮氣，對氮循環具有積極意義。本研究發現免耕土壤中Planctomycetes的相對豐度要遠高于旋耕土壤，其中需氧和厭氧的Planctomycetes的相對豐度在免耕土壤中都要更高，且好氧氨氧化相關功能的細菌豐度在免耕土壤中也更高，說明稻-油周年輪作免耕利于Planctomycetes群落的生長。本研究同時還發現，作為土壤無機氮供應能力的一個重要指標的脲酶活性在免耕模式中極顯著提高，說明稻-油系統免耕方式利于氮的固定和轉化。土壤微生物數量、土壤酶活性與土壤微生物群落結構組成等作為土壤健康的生物指標，可以用來指導農田的水肥管理，反映農田的健康情況及生產力大小[29-30]。本研究比較了傳統的微生物分離方法和基因組測序方法，發現從分子水平來解析土壤微生物能更全面地了解微生物群體的各項指標，能更深入地分析土壤微生物對外界環境地響應，有助于挖掘土壤微生態對耕作的響應機制。

對2種耕作方式作物產量的測定發現，在一個生產周期內，油菜免耕直播比旋耕移栽減產約300 kg/hm2，水稻免耕直播比旋耕拋栽減產約300 kg/hm2，說明不同耕作方式對產量的影響是明顯的。但從種植效益優勢的角度考慮，油菜免耕直播比旋耕移栽至少省30個工/hm2，水稻免耕直播也比旋耕拋栽省30個工/hm2，按每個工150元計算，一個周年內免耕節省9000元/hm2。而常規耕作產品經濟效益增加2220元/hm2（按油菜籽5元/kg，水稻2.4元/kg計算），再除去直播增加的種子成本約780元/hm2，最終一個周年內免耕可增收約6000元/hm2。盡管目前免耕措施對農作物產量的影響仍不明確，但出于種植效益的優勢，在適當的地點條件下采用免耕是可行的[31]。同時，研究者們認為免耕栽培需要在較長時間內，結合秸稈還田以及輪作等農藝措施，有助于其進一步發揮產量優勢以及對土壤健康的積極作用[31-32]。

洞庭湖區采用稻-油水旱輪作雙免耕雙直播種植模式，一方面不存在三熟制茬口季節緊張的問題，使土地得到休養生息；另一方面是對當前農村勞動力匱乏的一個解決之道，是多種因素共同作用下的相應調整。本研究明確了此種植模式下土壤微生物和酶活性的特征，為深入了解稻-油系統雙免耕雙直播條件下土壤微生態的改變提供了科學依據。