馬排卵期性激素含量變化及相關性分析

董 紅，鄭新寶，羅永明，陳 童，徐文慧，奴爾蘭·阿克亞孜，范洪先

（1.新疆畜牧科學院 畜牧研究所，烏魯木齊 830011；2.新疆伊犁國家農業科技園區管理委員會，新疆 昭蘇 835600；3.昭蘇縣畜牧獸醫發展中心，新疆 昭蘇 835600）

在繁殖季節，母馬在感受環境氣溫、光照變化的條件下，采食大量青草，膘情逐漸恢復，此時腦垂體釋放促卵泡素（FSH），在FSH的不斷作用下母馬子宮上卵巢多個卵泡逐漸發育；此外母馬卵巢還產生雌激素、促黃體生成素（LH）進入血液［1］。當血液中雌激素濃度不斷升高時，則抑制腦垂體FSH、LH的釋放。當FSH濃度開始不斷下降后，在競爭生長條件下只有一兩個卵泡發育成熟。LH的不斷釋放推動卵泡破裂成熟，卵子排出，然后進入發情交配、受精、妊娠階段，一般母馬懷孕產單胎，極個別為雙胎［2-3］。為了深入研究母馬發情季節生殖激素分泌變化規律，有必要進行排卵監測，這對誘導發情、實施同期發情有重要意義。

研究氣候、品種、年齡、營養等因素對母馬卵泡發育和排卵的影響［4-6］可以預測母馬發情排卵時間，推測最佳配種時間。試驗在卡拉蘇馬研究中心配種站選擇發情母馬122匹次，采集靜脈血測定FSH、LH、絨毛膜促性腺激素（hCG）、促性腺激素釋放激素（GnRH）、促甲狀腺激素釋放激素（TRH）含量變化，并輔助直腸檢查子宮卵巢、陰道狀態及母馬外觀行為表現，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2016—2020年在昭蘇縣畜牧獸醫站卡拉蘇馬研究中心馬場進行。

1.2 試驗動物及血液樣品的采集

在配種季節，在卡拉蘇馬研究中心配種站選擇發情母馬122匹次，馬群采用放牧方式飼養，使用一次性普通真空采血管，分別采集母馬卵泡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期頸部靜脈血，然后1 500 r/min離心5 min，血清冷凍保存，使用干冰運輸，送至北京金海科隅生物科技發展有限公司，使用酶聯免疫法檢測血清中FSH、LH、hCG、GnRH、TRH含量［7］。

根據卵巢上卵泡的形狀、大小、質地、波動和位置可判斷卵泡發育情況，一般將馬的卵泡期分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期，劃分標準［8］如下：（1）卵泡Ⅰ期。一側卵巢上出現小卵泡，直腸檢查手接觸有硬球的感覺，微突于卵巢表面，彈性強，無波動，排卵窩深。一般持續1～3 d。（2）卵泡Ⅱ期。小卵泡發育長大，卵泡液增多，卵泡柔軟有彈性，直腸檢查時觸摸有微小波動感。排卵窩由深變淺。此期持續1～3 d。（3）卵泡Ⅲ期。卵泡繼續長大，卵泡液更多了，直腸檢查時觸摸卵泡柔軟，彈性好，波動明顯，卵泡壁逐漸變薄，排卵窩較平。一般持續1～2 d。（4）卵泡Ⅳ期。卵泡長至最大，已成熟，直腸檢查時手觸能感覺到卵泡壁薄而緊張，有明顯波動感，排卵窩淺。一般持續1.0～1.5 d。（5）排卵Ⅴ期。卵泡壁很薄，緊張，彈性弱，有一觸即破感。此期一般持續2～8 h。有時直腸檢查，觸摸時卵泡突然破裂、排卵，可摸到排卵窩和卵泡膜。

1.3 激素的測定

酶聯免疫吸附（ELISA）技術是一種應用廣泛的檢測方法，具有快速、敏感、特異性強、簡便、易于標準化等優點，本試驗采用ELISA測定血清激素含量。主要步驟：（1）取血清樣品10μL加入酶標孔，加入樣品稀釋液40μL；（2）取標準品50μL加入酶標孔；（3）每孔加入酶標液100μL，蓋上貼紙，放入37℃溫箱反應1 h；（4）取出酶標板，用試劑盒自帶洗液（洗液1∶25倍稀釋）洗5遍，每遍間隔30 s，最后一遍甩干，在吸水紙上拍干；（5）每孔加入A液50μL，B液50μL，蓋上貼紙放入溫箱反應15 min；（6）取出酶標板加入終止液50μL，放入酶標儀檢測（酶標儀檢測選擇450 nm波長條件），讀取OD值［7-9］。

1.4 主要儀器和試劑

臺式離心機、便攜式B超儀、酶標儀、采血管、ELISA試劑盒、干冰。

1.5 數據的統計分析

采用Excel 2013軟件整理數據并繪制不同采樣期各種激素變化折線圖；用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，并進行不同采樣期的FSH含量、LH含量、hCG含量、GnRH含量、TRH含量 等指標之間的相關性分析。

2 結果與分析

2.1 血清激素指標統計

各采樣時期母馬血清激素含量見表1。

表1 血清激素的描述性統計分析

由表1可以看出：FSH、LH、hCG含量在Ⅱ期至Ⅳ期持續上升，在Ⅳ期達到最高，之后下降；Gn-RH含量在Ⅱ期至Ⅲ期下降，Ⅲ期至Ⅳ期上升，Ⅳ期至Ⅴ期下降；TRH含量在Ⅱ期至Ⅲ期下降，之后上升，不同卵泡期差異顯著（P＜0.01）。

2.2 血清激素指標相關性分析

對母馬血清中激素含量進行相關性分析，結果見表2。

表2 不同采樣期血清激素間的相關性分析

由表2可以看出：在Ⅱ期，TRH含量與GnRH、LH、FSH、hCG含量呈極顯著相關（P＜0.01），GnRH與FSH含量呈顯著相關（P＜0.05），hCG與LH、FSH含量呈極顯著相關（P＜0.01），LH 和FSH含量呈極顯著相關（P＜0.01）。

在Ⅲ期，TRH含量與GnRH、LH、FSH、hCG含量呈極顯著相關（P＜0.01），GnRH與FSH、LH、hCG含量呈極顯著相關（P＜0.01），hCG和LH、FSH含量呈極顯著相關（P＜0.01），LH和FSH含量呈極顯著相關（P＜0.05）。

在Ⅳ期，TRH含量與GnRH、LH、FSH、hCG含量呈極顯著相關（P＜0.01），hCG和LH、FSH含量呈極顯著相關（P＜0.01），LH和FSH含量極顯著相關（P＜0.01）。

在Ⅴ期（排卵后），TRH含量與GnRH、FSH、hCG含量呈極顯著相關（P＜0.01），GnRH與FSH含量呈極顯著相關（P＜0.01），hCG與LH、FSH含量呈極顯著相關（P＜0.01）。

3 討論與結論

FSH和LH是一類糖蛋白激素，由母畜腦垂體促性腺激素細胞分泌，受下丘腦GnRH、雌激素、抑制素調控，推動著發情周期的周期性變化。FSH可以促進卵泡生長發育成熟及影響雌激素分泌，LH可以促進母馬成熟卵泡排卵和黃體生長，促進黃體分泌雌激素、孕激素［10］。目前，有關哺乳動物的排卵詳細機制尚未完全明確，對靈長類動物的研究表明：發情排卵前后時期動物體內FSH、LH、雌激素以及GnRH等激素變化明顯，激素之間相互影響形成反饋調節，推動卵泡成熟、排卵，然后形成紅體、黃體、白體。雌激素峰值出現，誘導下丘腦GnRH釋放增加，推動LH、FSH達到分泌峰值。FSH和LH協同作用，誘導排卵時FSH和LH互相協同，使成熟卵泡破裂排卵。但單獨使用LH會造成卵巢上成熟和不成熟的卵泡全部破裂，這種現象產生的確切機制還有待進一步研究［11］。

GnRH是一種神經激素，由下丘腦分泌，促進FSH、LH釋放，排卵前LH分泌升高，推動雌激素分泌增多，雌激素刺激卵巢上受體合成多種酶，推動成熟卵泡頂部組織膠原纖維蛋白多糖變性，卵泡膜的黏合作用被破壞，卵泡液內蛋白水解酶、淀粉酶、膠原酶、透明質酸酶分泌增多，聯合作用促使卵泡壁溶解破裂，成熟卵子排出［12］。

TRH是由下丘腦室旁核內的神經細胞合成分泌的一種肽類激素，可以促使促甲狀腺激素（TSH）分泌增加，TSH的增多可以促進甲狀腺的分泌，使動物體對性激素敏感性增加，身體發熱，神經系統興奮，表現發情癥狀［13］。

馬的發情排卵主要發生在Ⅲ期～Ⅳ期，在本試驗中，馬群采用放牧方式飼養，比較難抓，采集同一匹放牧母馬血樣時，收集到的連續血樣以Ⅱ期～Ⅴ期的為主，很少采集到Ⅰ期～Ⅱ期連續樣本，血樣數量不夠，因此本試驗重點對比分析馬匹Ⅱ期～Ⅴ期的血液激素變化。

本試驗結果表明：（1）在母馬正常排卵期中卵泡Ⅱ期的FSH和LH、hCG是維持在低水平的，隨著卵泡逐漸生長變大，FSH、LH、hCG激素含量在GnRH的誘導下持續上升，直至排卵前會迅速升高，LH、hCG在排卵期可升高2倍，而FSH則為2，3倍左右，在Ⅳ期達到最高，形成優勢卵泡，然后卵泡破裂排卵，排卵之后進入Ⅴ期時FSH、LH、hCG激素含量迅速下降。（2）GnRH含量在Ⅱ～Ⅲ期有所下降，但差異不顯著，在即將排卵時分泌量上升，促進FSH、LH分泌，推動優勢卵泡排卵，排卵后含量又再次下降，FSH、LH含量也降低，卵巢恢復，開始準備下一個發情排卵周期。（3）TRH降低會引起母馬甲狀腺功能亢進，發情表現明顯，并停止采食，頻頻靠近公馬，嘶鳴，排卵后TRH含量升高，甲狀腺功能減退，興奮性逐漸下降，表現為安靜排卵，接收公馬爬跨配種。（4）不同采樣期比較而言，在排卵前的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期時，FSH和LH含量呈極顯著相關，均為逐漸升高，排卵后迅速下降。在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期hCG含量均與FSH、LH含量呈極顯著相關（P＜0.01），總體上呈現先升高后降低的趨勢。GnRH在Ⅱ期時與FSH含量呈顯著相關（P＜0.05），表現為促進FSH分泌；Ⅲ期時，GnRH含量與FSH、LH、hCG含量呈極顯著相關（P＜0.01）；Ⅴ期（排卵后）時與FSH含量呈極顯著相關（P＜0.01）。TRH含量始終與FSH、hCG、GnRH含量呈極顯著相關（P＜0.01），且與其他激素升降趨勢一致，TRH含量在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期與LH含量呈極顯著相關（P＜0.01），但是排卵后TRH與LH含量的相關性不顯著。

以上結果提示，在馬的繁殖季節，可以每天采血進行生殖激素監測，追蹤FSH、LH、hCG含量變化，當它們含量逐漸上升后，突然開始下降時，為最佳輸精時間。