健脾清腸方對(duì)慢性結(jié)腸炎IL-10-/-小鼠結(jié)腸組織 炎癥因子水平的影響

陳倩，陳幽蘭，戴彥成，張亞利，張紫薇，陳禹君，唐志鵬

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)脾胃病研究所，上海 200032； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405； 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200082

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種累及結(jié)腸的慢性炎癥性疾病，發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，發(fā)病機(jī)制尚不明確，包括遺傳易感性、上皮屏障缺陷、免疫反應(yīng)失調(diào)和環(huán)境因素[1]。臨床常用藥物包括氨基水楊酸制劑、激素、硫唑嘌呤等，但長(zhǎng)期使用這些藥物會(huì)降低療效，且伴隨著各種不良反應(yīng)，積極探索中醫(yī)藥治療UC的機(jī)制，可為UC的研究和治療提供新方向。健脾清腸方是本課題組在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中總結(jié)的治療UC有效方劑[2-4]，前期實(shí)驗(yàn)研究表明，健脾清腸方能明顯改善葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)UC小鼠結(jié)腸炎癥狀，其機(jī)制可能與抑制核因子-κB活化，下調(diào)白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-8、腫瘤壞死因子-α等炎性介質(zhì)，改善小鼠結(jié)腸上皮屏障功能有關(guān)[5-7]。此外，健脾清腸方還能通過抑制腸道炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、減少Cajal間質(zhì)細(xì)胞自噬，調(diào)節(jié)DSS誘導(dǎo)的UC小鼠腸動(dòng)力異常[8]。本研究以吡羅昔康誘導(dǎo)IL-10-/-小鼠慢性結(jié)腸炎為模型，觀察健脾清腸方對(duì)模型小鼠炎癥因子水平的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

IL-10-/-C57BL/6背景種鼠6只，購于上海南方模式生物科技股份有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0010。采用胚胎干細(xì)胞打靶方式，在IL-10基因exon1兩側(cè)分別插入loxP位點(diǎn)，即條件性敲除（CKO）小鼠。該flox小鼠與Dppa3-Cre品系小鼠交配，獲得IL-10敲除（KO）小鼠模型。種鼠在上海中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)及繁殖，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2020-0009，上海南方模式生物科技股份有限責(zé)任公司提供基因檢測(cè)服務(wù)。本研究獲得上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（PZSHUTCM190912020）。

1.2 藥物及制備

健脾清腸方（黃芪30g，黃連3g，黨參15g，馬齒莧30g，地榆15g，三七6g，白及3g，木香6g，甘草6 g），飲片由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房提供。取上述藥物6劑，浸泡后煎煮2次，濃縮至藥液體積為600 mL。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮后，將濃縮藥液置于四環(huán)凍干機(jī)制成凍干粉后密封，置于-20 ℃冰箱保存。

1.3 主要試劑與儀器

吡羅昔康，美國Sigma公司，批號(hào)STBJ5445；模型飼料由純化飼料（AIN93G）作為基礎(chǔ)料合成，江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司，批號(hào)20190907；糞便隱血試劑盒，珠海貝索企業(yè)，批號(hào)B190802；Trizol，美國Invitrogen公司，批號(hào)15596018；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit、熒光定量PCR試劑盒TB Green?Premix Ex TaqTM，日本TaKaRa公司，批號(hào)分別為AJ60658A、AJ61156A；小鼠IL-6、IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為NVLMK4NSMU、EXVY4GIJG5。NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（美國Thermo Scientific公司），StepOnePlus型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國 Applied Biosystems 公司），PCR儀（德國Eppendorf公司），Synergy4多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）。

1.4 分組、造模及給藥

IL-10-/-小鼠經(jīng)飼養(yǎng)、繁殖后，對(duì)F6代98只小鼠剪尾進(jìn)行基因檢測(cè)，結(jié)果顯示，其中48只小鼠IL-10-/-基因敲除。基因檢測(cè)結(jié)果見圖1（部分）。野生型（WT）即為IL-10基因未敲除，CKO為雜合子基因型，有且僅有在Dppa3-Cre表達(dá)情況下為IL-10 KO小鼠。

圖1 F6代小鼠部分基因檢測(cè)結(jié)果

IL-10-/-小鼠，6～8周齡，采用SPSS25.0軟件生成隨機(jī)數(shù)，分為空白組、模型組和健脾清腸方低、中、高劑量組，每組8只，雌雄各半。參考文獻(xiàn)[9]方法，將吡羅昔康以200 ppm添加于飼料中誘導(dǎo)IL-10-/-小鼠10 d，制備慢性結(jié)腸炎模型。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人體表面積折算系數(shù)計(jì)算小鼠給藥劑量15 g/（kg?d）作為健脾清腸方中劑量，健脾清腸方低、高劑量分別為10、22.5 g/（kg?d）[10]。造模的同時(shí)開始小鼠灌胃給藥，給藥組小鼠予0.3 mL健脾清腸方灌胃，模型組和空白組予等體積生理鹽水灌胃。每日1次，連續(xù)14 d。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)

每日觀察小鼠一般情況，稱量體質(zhì)量，觀察糞便性狀，檢驗(yàn)糞便隱血情況，進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分（見表1），計(jì)算各項(xiàng)分?jǐn)?shù)平均數(shù)作為最終結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)估。

表1 慢性結(jié)腸炎小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分

1.5.2 HE染色

取小鼠近端結(jié)腸，10%中性福爾馬林緩沖液固定，沖洗組織包埋盒4 h，石蠟包埋，切片，HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.3 白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β基因表達(dá)檢測(cè) 稱取50 mg小鼠結(jié)腸組織，加1 mL Trizol，反復(fù)勻漿直至液體澄清，室溫靜置，吸取上清液；加入氯仿待分層出現(xiàn)后，12 000 r/min離心15 min，吸取上層水相（RNA層）；加等體積異丙醇混勻，離心后棄上清，RNA沉淀為小塊；加入75%乙醇1 mL，輕微震蕩洗滌，離心后棄上清，倒置EP管，自然控干RNA沉淀；加入適量RNA-free水溶解RNA，進(jìn)行RNA濃度測(cè)定。參照Takara試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。引物由上海閃晶分子生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成（見表2），并用Blast程序進(jìn)行驗(yàn)證。RT-PCR反應(yīng)：配制20 μL反應(yīng)體系，按試劑盒說明書進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，以2-ΔΔCt法分析mRNA表達(dá)水平。

表2 PCR各基因引物序列

1.5.4 白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β含量測(cè)定

稱取50 mg小鼠結(jié)腸組織，加1 mL預(yù)冷PBS，勻漿30 s后取出，勻漿管置于冰上，靜置5 min，再反復(fù)勻漿，直至勻漿管中未見明顯結(jié)腸組織，最后將勻漿液5 000×g離心5 min，取上清液備用；將組織勻漿液稀釋5倍作為待測(cè)樣品，于酶標(biāo)板各孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品各100 μL，37 ℃孵育90 min；倒去孔內(nèi)液體后加入100 μL生物素化抗體工作液，37 ℃孵育60 min；洗滌后加入100 μL酶結(jié)合物工作液，37 ℃孵育30 min；洗滌后加入90 μL底物溶液，37 ℃孵育15 min，立即加入50 μL終止液，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔光密度（OD值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組樣品濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，符合正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)用方差分析，組間比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

空白組小鼠表現(xiàn)為反應(yīng)靈敏，皮毛光澤，體質(zhì)量正常增長(zhǎng)，糞便麥粒狀；模型組小鼠表現(xiàn)為蜷臥懶動(dòng)、反應(yīng)遲鈍、毛色黯淡、爪甲發(fā)白，體形消瘦，糞質(zhì)較軟，甚至出現(xiàn)肉眼血便，其中因便血嚴(yán)重、體質(zhì)量下降明顯死亡2只；健脾清腸方各劑量組小鼠上述表現(xiàn)均有不同程度改善。給藥第10日，健脾清腸方高劑量組小鼠體質(zhì)量較模型組小鼠明顯增加（P＜0.05），給藥第14日，健脾清腸方各劑量組小鼠體質(zhì)量較模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率比較（±s，%）

表3 各組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率比較（±s，%）

注：與模型組比較，#P＜0.05

組別 只數(shù) 第1日 第10日 第14日 空白組 8 1.12±1.82 7.10±3.66 7.50±6.91模型組 6 -2.09±1.77 -13.63±6.24 -4.92±7.62健脾清腸方低劑量組 8 -2.45±3.99 -11.59±7.76 0.39±6.01健脾清腸方中劑量組 8 -1.35±2.73 -11.86±5.01 0.33±3.29健脾清腸方高劑量組 8 0.39±6.07 -6.08±7.76# 1.89±6.63

2.2 健脾清腸方對(duì)模型小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分的影響

與模型組比較，給藥第10日，健脾清腸方低、高劑量組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分顯著減少（P＜0.05）；給藥第14日，健脾清腸方各劑量組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分顯著減少（P＜0.05）；健脾清腸方各劑量組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分比較（±s）

表4 各組小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分比較（±s）

注：與模型組比較，#P＜0.05

組別 只數(shù) 第1日 第10日 第14日 模型組 6 1.10±0.25 3.10±0.63 2.19±0.57 健脾清腸方低劑量組 8 1.25±0.43 2.50±0.78# 1.58±0.53#健脾清腸方中劑量組 8 1.05±0.30 2.57±0.66 1.48±0.50#健脾清腸方高劑量組 8 1.00±0.42 2.11±0.72# 1.39±0.65#

2.3 HE染色結(jié)果

模型組小鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)明顯黏膜損傷，腺體排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及潰瘍形成；健脾清腸方各劑量組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜充血水腫較模型組減輕，炎性細(xì)胞明顯減少，腸黏膜有不同程度修復(fù)，腺體排列較為規(guī)整，潰瘍形成情況明顯緩解。結(jié)果見圖2。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)（HE染色）

2.4 健脾清腸方對(duì)模型小鼠結(jié)腸組織白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，健脾清腸方各劑量組小鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；健脾清腸方各劑量組小鼠結(jié)腸組織IL-6 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與健脾清腸方中劑量組比較，健脾清腸方高劑量組小鼠結(jié)腸組織IL-1β mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)比較（±s）

2.5 健脾清腸方對(duì)模型小鼠結(jié)腸組織白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-1β含量明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，健脾清腸方各劑量組小鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-1β含量明顯減少（P＜0.05）。結(jié)果見圖4。

圖4 各組小鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-1β含量比較（±s）

3 討論

UC屬中醫(yī)學(xué)“休息痢”“久痢”“腸澼”等范疇，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、里急后重、黏液膿血便等癥。《景岳全書》有“泄瀉之本，無不由于脾胃……飲食失節(jié)，起居不時(shí)，以致脾胃受傷，則水反為濕，谷反為滯，精華之氣不能輸化，乃至合污下降，而瀉痢作矣”，詳述脾虛導(dǎo)致瀉痢的病理過程。《沈氏尊生書》記載“大抵痢之病根，皆由濕蒸熱壅，以至氣血凝滯，漸至腸胃之病”。脾喜燥惡濕，水濕羈留于腸間，郁久化熱，濕熱搏結(jié)，下注大腸，損傷腸道脂膜血絡(luò)，腐而為膿，從而導(dǎo)致UC發(fā)生。由此可知，脾氣虛弱是UC的發(fā)病基礎(chǔ)，濕熱瘀結(jié)是UC的重要病理因素。

本實(shí)驗(yàn)采用的IL-10-/-小鼠是一種廣泛用于分析炎癥性腸病（IBD）病因的基因工程模型，由Kühn等[11]于1993年建立。IL-10是一種具有強(qiáng)烈抗炎活性的細(xì)胞因子，可阻斷多種炎性細(xì)胞的誘導(dǎo)合成。研究表明，IL-10及其受體的突變參與了早發(fā)性IBD的發(fā)病，證實(shí)IL-10-/-小鼠模型具有臨床相關(guān)性[12-13]。IL-10-/-小鼠出生后3～6個(gè)月可自發(fā)產(chǎn)生慢性IBD，可能與腸道黏膜暴露于食物和細(xì)菌抗原中，這些抗原刺激免疫系統(tǒng)，由于缺乏IL-10抑制免疫反應(yīng)，促炎細(xì)胞因子持續(xù)過量產(chǎn)生有關(guān)，導(dǎo)致腸道炎癥[14]。研究表明，當(dāng)暴露于非甾體抗炎藥如吡羅昔康時(shí)，IL-10-/-小鼠2周內(nèi)迅速發(fā)展為中重度結(jié)腸炎，并在停藥后轉(zhuǎn)為慢性病程[15-16]。IL-10-/-小鼠腸道炎癥具有與人類IBD相似的組織學(xué)特征，包括固有層和黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩膿腫、潰瘍和腸壁增厚[17]。經(jīng)典的DSS模型是通過化學(xué)試劑破壞小鼠腸黏膜屏障，從而引發(fā)炎性反應(yīng)，這與人類IBD由飲食、免疫、感染等多種因素誘發(fā)的機(jī)制有較大差別，且DSS模型維持時(shí)間短，具有一定自愈性，對(duì)慢性UC模型而言，需DSS反復(fù)刺激才能維持炎癥癥狀[18]。與DSS模型比較，IL-10-/-小鼠由于缺失了免疫相關(guān)的IL-10基因而表現(xiàn)出結(jié)腸炎癥和病理變化，在停藥后轉(zhuǎn)為慢性病程不會(huì)自愈，能更好地模擬人類IBD，對(duì)我們深入探究該疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)HE染色結(jié)果顯示，模型組小鼠結(jié)腸上皮出現(xiàn)明顯潰瘍，腺體排列紊亂，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示造模成功。

IL-6是一種功能廣泛的多效性細(xì)胞因子，在IBD慢性炎性反應(yīng)的持續(xù)發(fā)展中起關(guān)鍵作用[19]。研究表明，DSS誘導(dǎo)的小鼠血清和結(jié)腸組織IL-6增多，表明IL-6參與了UC的發(fā)病，可能是監(jiān)測(cè)UC活動(dòng)度和療效的標(biāo)志性細(xì)胞因子之一[20]。IL-1β屬IL-1家族細(xì)胞因子，由單核巨噬細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生，可激活致病性T細(xì)胞，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)[21]。免疫細(xì)胞通過調(diào)節(jié)IBD患者全身細(xì)胞因子水平，從而影響局部腸道炎癥和組織損傷，阻斷這些炎癥介質(zhì)是減輕甚至逆轉(zhuǎn)IBD癥狀的機(jī)制之一[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-1β含量及mRNA表達(dá)均明顯升高，證實(shí)IL-6、IL-1β參與了吡羅昔康誘導(dǎo)的IL-10-/-小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的產(chǎn)生，而健脾清腸方干預(yù)能調(diào)節(jié)小鼠腸道炎癥因子分泌，降低炎癥因子水平。

健脾清腸方由9味中藥組成，每味中藥都含有多種化合物，其中包括已知抗UC的成分。如黃芪主要活性成分黃芪多糖可減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎嚴(yán)重程度，其作用機(jī)制可能與抑制核因子-κB激活有關(guān)[23]；黨參主要有效成分黨參多糖和黨參皂苷能協(xié)同調(diào)節(jié)促炎/抗炎因子平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答，抑制病原菌定殖，從而減輕UC小鼠結(jié)腸炎癥狀[24]；馬齒莧提取物可減輕UC小鼠疾病嚴(yán)重程度，其作用機(jī)制可能與下調(diào)炎性因子、激活PPARγ有關(guān)[25]。

綜上，健脾清腸方可促進(jìn)損傷的結(jié)腸黏膜修復(fù)，可能與下調(diào)IL-10-/-小鼠腸道局部IL-6、IL-1β的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平有關(guān)，多種化合物協(xié)同效應(yīng)可能是健脾清腸方發(fā)揮治療UC作用的關(guān)鍵所在，在今后的研究中仍需進(jìn)一步探索。