基于Ras/ERK信號通路益腎通癃湯對人前列腺癌 PC-3細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響

劉德果，李姿蓉，陳其華，趙姣，楊磊，李博，向時竹，林夢姣

1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410207； 2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410008

前列腺癌早期癥狀相對隱匿，缺少特征性臨床表現，多數被確診的患者已是腫瘤中晚期階段，失去手術治療的機會，只能采用內分泌及化療手段治療。前列腺癌發病機制至今仍未完全明確，前列腺癌細胞的增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學過程受到諸多基因的調控與影響[1]。因此，研究相關基因對前列腺癌細胞生物學過程的作用機制將給本病的防治提供確切有效的治療靶點。研究發現，Ras/ERK信號通路是調控前列腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學過程的關鍵通路[2]。Semenchenko等[3]研究表明，在前列腺癌組織中Ras致癌突變表達水平較正常前列腺組織顯著升高，且Ras致癌突變高表達患者更易于發生遠處轉移。臨床及基礎研究表明，中醫藥在改善前列腺癌具體臨床癥狀、延緩內分泌耐受、改善生活質量、調護心理健康等方面有較好的療效[4-5]。益腎通癃湯是湖南中醫藥大學第一附屬醫院治療前列腺癌的經驗方，近20年臨床應用表明，其能明顯緩解前列腺癌患者排尿困難、食欲減低、乏力等臨床癥狀，明顯提高患者生活質量，降低炎性相關指標水平，并對化療藥物起到減毒增效的作用[6]，但其具體機制仍需進一步探討。本研究以人前列腺癌PC-3細胞為研究對象，從Ras/ERK信號通路調控角度探討益腎通癃湯對PC-3細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響。

1 實驗材料

1.1 細胞

人前列腺癌PC-3細胞株，購于中國醫學科學院腫瘤細胞庫（目錄號TCHu158）。

1.2 動物

選取SPF級雄性SD大鼠30只進行藥物血清制備，體質量180～220g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物使用許可證號SYXK（湘）2019-0009，生產許可證號SCXK（湘）2019-0004。飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心SPF級動物房，溫度21～25 ℃，相對濕度40%～70%，每日按時喂養。

1.3 藥物

益腎通癃湯（補骨脂15g，熟地黃15g，黃芪30g，三棱10g，莪術10 g），飲片購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，均為超微中藥，本院制劑室根據臨床等效劑量[7]水煎濃縮后制成膏劑，其終濃度為含原藥材1.44 g/mL，置于無菌棕色瓶，4 ℃冰箱保存備用。

1.4 主要試劑與儀器

RPMI 1640細胞培養基，美國Gibco公司，批號8120357；胎牛血清，美國Gibco公司，批號42G3099K；CCK-8試劑盒，日本Dojindo公司，批號JP198233；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，日本Dojindo公司，批號VN833；RIPA裂解液，美國賽默飛世爾公司，批號33454712；BCA蛋白濃度測定試劑盒，美國賽默飛世爾公司，批號YP195441；溴化乙錠，美國賽默飛世爾公司，批號CC3348574；RNase A，美國賽默飛世爾公司，批號LD45845；PVDF膜，Millipore公司，批號K8A4571；鋅指轉錄因子（Snail）、Ras、細胞外調節蛋白激酶1/2（ERK1/2）、p-ERK1/2、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）抗體，美國賽默飛世爾公司，貨號分別為10H8L11、Thr185、5AD13MA、6D2、CDH1、8C11、IIA5。超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司，型號SW-CJ-2FD），CO2細胞培養箱（日本Panasonic公司，型號MCO-20AIC），酶標儀（美國MD公司，型號SpectraMax i3），電子顯微鏡（日本Olympus公司，型號TH4-200），流式細胞儀（美國BD公司，型號LSRⅡ）。

2 實驗方法

2.1 藥物血清制備

實驗大鼠適應性喂養3 d，按隨機數字表法分為空白血清組和藥物血清組。將益腎通癃湯膏劑加入蒸餾水，益腎通癃湯膏低（0.36 g/mL）、中（0.72 g/mL）、高劑量（1.44 g/mL）組予相應劑量藥液灌胃，空白血清組大鼠予等體積生理鹽水灌胃。早晚各1次，連續7 d。末次給藥后1 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，靜置2 h，離心，過濾，滅活，吸取上清液，即為藥物血清或空白血清。同時細胞毒性實驗顯示，PC-3細胞最大耐受劑量為14.5 g/（mL?d），故本研究給藥劑量并未影響本實驗結果。

2.2 細胞培養及分組

PC-3細胞置于37 ℃、5%CO2培養箱，用含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1640培養基培養。培養48～72 h，0.25%胰酶消化傳代，取對數生長期細胞用于后續實驗。將PC-3細胞分為空白血清組、益腎通癃湯含藥血清高、中、低劑量組（益腎通癃湯高、中、低劑量組），空白血清組予空白血清干預，益腎通癃湯高、中、低劑量組分別予高、中、低劑量益腎通癃湯含藥血清干預。48 h后進行相關檢測，細胞抑制率檢測時間點為24 h及48 h。

2.3 細胞增殖檢測

采用CCK8法檢測PC-3細胞增殖，計算細胞抑制率。細胞抑制率（%）＝（1－實驗組吸光度值÷對照組吸光度值）×100%。

2.4 細胞凋亡檢測

采用Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細胞凋亡。收集PC-3細胞，洗滌后以標記液重懸細胞，25 ℃避光孵育15 min。1500r/min離心15 min，取細胞沉淀加熒光（SA-Flous）溶液，低溫孵育15 min。按照標準程序使用流式細胞儀檢測，結果用ModFit LT軟件進行處理。

2.5 細胞侵襲、遷移檢測

采用Transwell小室法檢測PC-3細胞侵襲及遷移。制備Transwell小室，加基礎培養基及Matergel，37 ℃水化基底膜。將PC-3細胞制成密度為1×105個/mL的細胞懸液，吸取適量懸液加至上室，下室加含10%FBS完全培養基，避光孵育24 h；洗凈后用甲醇固定30 min，0.5%結晶紫染色5 min，鏡下觀察并拍照。細胞遷移實驗同侵襲實驗，無Matergel包被步驟。

2.6 Western blot檢測相關蛋白表達

提取PC-3細胞蛋白，高速離心15 min，吸取上清液，BCA法檢測蛋白濃度。電泳后轉至PVDF膜，加5%胎牛血清白蛋白，37 ℃封閉1.5 h，洗膜后加Snail、Ras、p-ERK1/2、ERK1/2、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9一抗，4 ℃孵育過夜。次日加二抗37 ℃孵育1.5 h，顯影，結果運用Image Lab軟件進行處理，以GAPDH為內參，計算目的蛋白表達量。

2.7 RT-PCR檢測相關蛋白mRNA表達

收集PC-3細胞，提取總RNA，并測定其濃度，根據試劑盒說明書進行操作。經濃度及純度檢測后，根據試劑盒說明書合成cDNA，并以β-actin為內參，SYBR Green PCR試劑盒擴增Ras、ERK1、E-cadherin、N-cadherin，每組設置3個復孔，以相對定量2-ΔΔCt法分析基因相對表達量。

3 統計學方法

采用SPSS22.0統計軟件進行分析。實驗數據以±s表示，組間比較用方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 益腎通癃湯藥物血清對PC-3細胞增殖的影響

與空白血清組比較，益腎通癃湯高、中、低劑量組可顯著抑制PC-3細胞增殖，降低其貼壁生長能力（P＜0.01），并呈劑量依賴性，除益腎通癃湯低劑量組外，隨著作用時間延長，抑制率有所增加。見圖1。

圖1 各組PC-3細胞不同時點細胞抑制率比較（±s，n＝3）

4.2 益腎通癃湯藥物血清對PC-3細胞凋亡的影響

與空白血清組比較，益腎通癃湯高、中、低劑量組均可顯著促進PC-3細胞凋亡（P＜0.05），并呈劑量依賴性。見圖2。

圖2 各組PC-3細胞凋亡比較（±s，n＝3）

4.3 益腎通癃湯藥物血清對PC-3細胞侵襲、遷移的影響

與空白血清組比較，益腎通癃湯高、中、低劑量組可顯著降低PC-3細胞體外侵襲、遷移能力（P＜0.05），并呈劑量依賴性。見圖3、圖4。

圖4 各組PC-3細胞遷移能力比較（±s，n＝3）

4.4 益腎通癃湯對PC-3細胞蛋白表達的影響

與空白血清組比較，益腎通癃湯高、中、低劑量組PC-3細胞Snail、Ras、p-ERK1/2、ERK1/2、N-cadherin、MMP-9蛋白表達均下調，E-cadherin蛋白表達明顯上調（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5、表1。

圖5 各組PC-3細胞蛋白免疫印跡圖

表1 各組PC-3細胞Snail、ERK1/2、p-ERK1/2、Ras、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9蛋白表達比較（±s）

表1 各組PC-3細胞Snail、ERK1/2、p-ERK1/2、Ras、E-cadherin、N-cadherin、MMP-9蛋白表達比較（±s）

注：與空白血清組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與益腎通癃湯低劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與益腎通癃湯中劑量組比較，△P＜0.05

組別 n Snail EPK1 EPK2 p-EPK1 p-EPK2 空白血清組 3 1.01±0.06 0.97±0.08 1.02±0.06 1.07±0.14 0.93±0.05 益腎通癃湯低劑量組 3 0.73±0.03** 0.78±0.04** 0.66±0.04** 0.95±0.06* 0.72±0.03* 益腎通癃湯中劑量組 3 0.74±0.04** 0.70±0.02**# 0.57±0.01**# 0.73±0.04**# 0.64±0.02**# 益腎通癃湯高劑量組 3 0.52±0.02**#△ 0.61±0.02**##△ 0.47±0.01**##△ 0.64±0.02**##△ 0.51±0.01**##△ 組別 n Ras E-cadherin N-cadherin MMP-9 空白血清組 3 1.06±0.05 0.56±0.05 0.91±0.07 1.02±0.07 益腎通癃湯低劑量組 3 0.73±0.02** 0.88±0.04** 0.74±0.02** 0.78±0.03** 益腎通癃湯中劑量組 3 0.63±0.01**# 1.02±0.06**# 0.65±0.02*# 0.71±0.05**# 益腎通癃湯高劑量組 3 0.57±0.01**#△ 1.13±0.08**#△ 0.47±0.01**##△ 0.53±0.03**##△

4.5 益腎通癃湯對PC-3細胞mRNA表達的影響

與空白血清組比較，益腎通癃湯低、中、高劑量組PC-3細胞Ras、ERK1、N-cadherin mRNA表達顯著下調，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；益腎通癃湯高、中劑量組PC-3細胞E-cadherin mRNA表達顯著上調，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）；益腎通癃湯低劑量組PC-3細胞E-cadherin mRNA表達變化不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組PC-3細胞Ras、ERK1、E-cadherin、N-cadherin mRNA表達比較（±s）

表2 各組PC-3細胞Ras、ERK1、E-cadherin、N-cadherin mRNA表達比較（±s）

注：與空白血清組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與益腎通癃湯低劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與益腎通癃湯中劑量組比較，△P＜0.05

組別 n Ras ERK1 E-cadherin N-cadherin 空白血清組 3 1.04±0.05 0.98±0.06 0.69±0.05 1.02±0.07 益腎通癃湯低劑量組 3 0.83±0.05* 0.82±0.04* 0.68±0.04 0.92±0.05* 益腎通癃湯中劑量組 3 0.67±0.04**# 0.67±0.05*# 0.92±0.04*# 0.64±0.04**# 益腎通癃湯高劑量組 3 0.52±0.04**#△ 0.60±0.03**#△ 1.21±0.06**##△ 0.56±0.05**#△

5 討論

根據臨床表現，前列腺癌屬中醫學“癥瘕”“積聚”“癃閉”等范疇。全國名中醫陳其華教授認為陰陽失調是前列腺癌發生的基本病機，陽虛陰結是對前列腺癌病機的高度概括，機體陽氣虛衰，臟腑功能失調，正氣無力抗邪，各類病理產物如瘀血、痰濁、濕阻、癌毒等阻滯氣機，氣血不行，膠結于下焦精室，終致本病發生。前列腺癌多為本虛標實之證，往往以陽氣虧虛為本，瘀毒久積、邪郁下焦為標，虛、毒、瘀夾雜，以虛為主。益腎通癃湯方中補骨脂溫腎助陽、固精縮尿、補益精血，激發腎中陽氣。現代藥理研究表明，補骨脂具有提升免疫、抗氧化、抗腫瘤作用，其化學成分補骨脂定及補骨脂素能顯著抑制癌細胞增殖、侵襲、轉移[8-9]；熟地黃補血養陰、填精益髓，為補益精血之要藥，同時熟地黃與補骨脂陰陽相得，互為補充；黃芪益氣升陽，為補氣要藥，氣行則血行，使瘀滯得散，陰寒、痰濁、瘀毒更無滯停之處，則“陰結”之癌瘤自消；三棱、莪術為攻積除堅經典藥對，癌毒留戀絡脈，血瘀、痰濁、寒凝等膠結積聚，三棱、莪術為化瘀散結通絡要藥。全方攻補兼施，諸藥合用，共達陰陽雙補、抗癌解毒、化痰散瘀之功。

本課題組前期臨床研究顯示，益腎通癃湯能有效治療前列腺癌[6]。Moore等[10]研究表明，惡性腫瘤的發病、侵襲、轉移等生物學過程均與眾多細胞內信號通路異常激活相關，此類信號通路異常激活造成的細胞增殖、細胞周期、凋亡、遷移、侵襲等生物學過程異常是惡性腫瘤發生的標志性特征之一。Ras/ERK信號通路目前被發現在真核細胞中廣泛存在，其主要功能是調控組織細胞的終末分化、分裂增殖、周期、凋亡、侵襲及轉移等生物學行為[11]。研究顯示，Ras/ERK信號通路在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、口腔癌等多類惡性腫瘤的發生、發展及侵襲轉移進程中扮演重要角色[12]。在Ras/ERK信號通路中，Ras蛋白是原癌基因c-ras的表達產物，也是惡性腫瘤發生過程中最常見的突變蛋白；ERK蛋白是Ras/ERK信號通路下游的關鍵蛋白，ERK被激活后經細胞內環境運送至細胞核，對細胞內諸多信號通路的重要因子進行激活或滅活，調控相應的關鍵靶基因轉錄，使相關蛋白表達或活性異常，最終推進相應基因表觀修飾異常，導致細胞增殖及惡性轉化[13]。Ngalame等[14]在前列腺癌組織中發現Ras/ERK信號通路異常激活，其通過激活該信號通路下游轉錄因子，促進細胞過度增殖，導致前列腺癌發生。

此外，Wang等[15]認為，前列腺癌細胞增殖、侵襲及遷移是前列腺癌發生發展的病理基礎，而上皮間質轉化（EMT）是前列腺癌發生及遠處轉移的必經過程。Qiu等[16]研究顯示，Ras/ERK信號通路與EMT密切相關。Cai等[17]研究表明，前列腺癌細胞EMT一旦激活，其腫瘤細胞各種惡性生物學行為明顯提升，并調控前列腺癌發展，該過程中E-cadherin扮演關鍵性角色，而N-cadherin則與之相反。Snail是前列腺癌發生發展及EMT過程中的主要調節因子，其通過調節E-cadherin表達推進EMT過程[18]。MMP-9是關鍵細胞外基質蛋白水解酶，其可直接調控惡性腫瘤的發生、侵襲及轉移進程，也可通過水解細胞外基質，調控細胞黏附及腫瘤微小血管生成，在癌性浸潤進程中起關鍵作用。

本研究結果顯示，益腎通癃方能有效抑制前列腺癌細胞增殖，促進其凋亡，并能降低前列腺癌細胞侵襲及遷移能力。同時益腎通癃湯各劑量均可下調Snail、Ras、p-ERK1/2、ERK1/2、N-cadherin、MMP-9蛋白的表達，上調E-cadherin表達，降低Ras、ERK1、N-cadherin mRNA的表達，上調E-cadherin mRNA的表達，提示益腎通癃湯治療前列腺癌的作用機制可能與其抑制前列腺癌EMT進程，調控Ras/ERK信號通路活化有關。但益腎通癃湯抑制前列腺癌細胞增殖及侵襲、促進其凋亡是直接還是間接通過Ras/ERK信號通路，抑制前列腺癌EMT是否還存在其他關鍵細胞內信號通路，仍需今后進一步深入研究。