利用民豬耳緣組織重復培養成纖維細胞的研究

王春安，狄生偉，付德昌，鄭 鵬

（1 黑龍江昇太牧業發展有限公司，黑龍江 蘭西 151500；2 東北農業大學 動物科學技術學院，哈爾濱 150030）

中國是世界第一養豬大國，具有豐富的豬種資源，中國的豬種資源對世界的養豬生產和豬的育種都具有重要意義。然而由于各種原因，有些地方豬種數量急劇下降，甚至絕種，因此，亟需加強地方豬種的活體保存及利用生物技術保存種質資源［1-3］。

民豬是中國東北地區一個古老的地方豬種，具有產仔多、肉質好、抗寒、耐粗飼的突出優點［4］，是受保護的國家級地方品種。可以采用細胞培養技術從細胞水平保存民豬這一重要遺傳資源。

利用豬的耳緣組織培養成纖維細胞是一種操作簡單、常用的方法，為了在動物組織塊的再利用、遺傳資源的保存中探索一種新的保存方法，試驗在采用植塊法培養民豬耳緣組織成纖維細胞的基礎上，進一步探討了組織塊的再培養和冷凍保存后再培養的方法，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

民豬，為飼養在黑龍江省蘭西縣種豬場（黑龍江昇太牧業發展有限公司）內的保種種豬，按照飼養標準飼喂，自由飲水。按照家系、個體之間沒有親緣關系進行選擇，共采集45頭民豬耳緣組織。

1.2 主要試劑

DMEM/F-12、胎牛血清（FBS），購自HyClone公司；雙抗，為100×青霉素-鏈霉素溶液，100 mL裝，每毫升含10 000 U 青霉素和10 mg 鏈霉素，Biosharp 公司產品；其他試劑如無特殊說明，均購自Sigma公司。

細胞培養基：DMEM/F-12+15%FBS+1%雙抗（10 mg/mL的青霉素和鏈霉素）。消化液：0.25%胰蛋白酶（Amresco）。細胞凍存液：DMEM/F-12+15%FBS+10%二甲基亞砜（DMSO）+1%雙抗。

1.3 耳緣組織采集

保定豬只，用75%酒精棉擦洗采樣部位，用耳號鉗在原有耳缺的部位剪下1塊耳組織，放入添加2%雙抗的PBS 的離心管內搖晃、清洗；然后將組織塊移入有75%酒精的離心管內涮洗10 s 消毒；再將組織塊移入2%雙抗的PBS中搖晃清洗，去除殘余酒精；最后將組織塊放入含2%雙抗的PBS的離心管中，置于4 ℃采樣箱內，送回實驗室。

1.4 組織塊處理

將運回實驗室的組織塊移入75%酒精中浸泡10 s進行初步滅菌；隨后用含2%雙抗的PBS清洗；將組織塊移入玻璃皿中，用滅菌手術刀將毛發充分刮凈，用含2%雙抗的PBS 清洗后，再次將組織塊移入75%酒精中浸泡10 s；再用含2%雙抗的PBS 清洗，去除殘余酒精；將組織塊移入加有培養液的玻璃皿中。

1.5 組織塊的植塊培養

用滅菌眼科剪將組織塊剪成1 mm3塊，用培養液清洗組織塊后浸泡在培養液內；用牙簽或鑷子將剪碎的組織塊擺到新的60 mm 培養皿內，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中；過夜培養后，組織塊牢固地貼在底壁上，加入新鮮的培養液繼續培養；每2～3 d 換一次培養液，直到細胞生長至90%；采用胰酶進行消化，傳代。

1.6 組織塊的再培養

將1.5中組織塊生長出的細胞進行消化、傳代后，剩余的組織塊用培養液清洗一遍，將組織塊擺到新的60 mm 培養皿內，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中，重新進行植塊法培養；過夜培養后，組織塊牢固地貼在底壁上，再加入新鮮的培養液繼續培養；每2～3 d換一次培養液。

1.7 組織塊冷凍后的再培養

將1.5中的組織塊生長出的細胞進行消化、傳代后，將剩余的組織塊用培養液清洗一遍，15～20 個組織塊加入1.5 mL 冷凍液，移入1.8 mL凍存管內，將凍存管放入細胞凍存盒內，置于-80 ℃冰箱內過夜，然后置于液氮內保存。冷凍保存20 d后，用37 ℃溫水解凍，用培養液對組織塊進行清洗，再按照1.6 的方法重新進行植塊法培養。

1.8 細胞的傳代培養與生長曲線繪制

當組織塊法培養的細胞長滿皿底后，用胰酶進行消化、傳代，觀察細胞的生長形態。選擇第二代的成纖維細胞，用胰酶消化，制成細胞懸液，調整細胞密度為1×104個/mL，用96孔培養板培養，每孔接種100 μL，每2 d 換液1 次，每24 h 計數1 次，每次每組取3 孔，每孔計數3 次，求平均值。以細胞密度（個/mL）為縱坐標、培養天數（d）為橫坐標繪制生長曲線。

2 結果

2.1 植塊法培養成纖維細胞

新鮮豬耳緣皮膚組織貼壁5 d后，可見組織塊周圍有細胞游離出來并貼壁生長，細胞呈圓形、梭形、三角形等形態。隨著培養時間的延長，組織塊周圍的細胞生長速度增加。除成纖維細胞外，還可以見到上皮細胞、圓形細胞，其中上皮細胞圍繞組織塊，緊靠組織塊生長，成纖維細胞迅速向外周生長，并逐漸成為優勢生長的細胞（見圖1A）。培養15 d后，細胞逐漸鋪滿皿底（圖1B），可以進行傳代培養。利用此種方法，培養了45 頭民豬的成纖維細胞。

圖1 新鮮組織塊經植塊法培養的成纖維細胞

2.2 成纖維細胞的傳代

成纖維細胞長滿皿底后可以進行傳代，利用成纖維細胞和上皮細胞對胰酶敏感性的不同來控制消化時間，將成纖維細胞和上皮細胞分開。當成纖維細胞已經脫離皿底、而上皮細胞沒有脫離時，終止消化（見圖2），然后收集成纖維細胞進行冷凍保存或傳代。

圖2 植塊法培養的成纖維細胞的消化

2.3 組織塊的再培養

新鮮的組織塊進行植塊法培養成纖維細胞，當組織塊周圍長滿細胞后，進行消化、吹打，然后將組織塊用培養液清洗一遍，重新進行植塊法培養。培養3 d后，可見組織塊周圍已經有成纖維細胞生長（見圖3A），隨著時間的增長，組織塊周圍的細胞逐漸增多（見圖3B）。

圖3 生長出細胞的組織塊的再植塊培養

2.4 組織塊冷凍后再培養

新鮮的組織塊進行植塊法培養成纖維細胞，當組織塊周圍長滿細胞后進行消化、吹打，然后將組織塊用培養液清洗一遍，按照冷凍細胞的方法進行冷凍；冷凍20 d 后解凍，用培養液清洗一遍，重新進行植塊法培養。培養3 d后，可見組織塊周圍已經有成纖維細胞生長，隨著時間的增長，組織塊周圍的細胞逐漸增多（見圖4）。

2.5 不同處理對組織塊的細胞生長的影響

見表1。

表1 不同處理對組織塊的細胞生長的影響（n=5）

試驗經過采用新鮮組織塊直接培養、長出細胞的組織塊再培養、長出細胞的組織塊冷凍后再培養，結果表明，組織塊再培養、組織塊冷凍后再培養后長出細胞時間和細胞傳代時間都比新鮮組織塊提前2 d，而且組織塊再培養時污染比率明顯低于新鮮組織塊。

2.6 成纖維細胞的傳代培養與生長曲線

3 種培養方法獲得的成纖維細胞經過消化傳代后進行培養，細胞貼壁生長，形態正常（見圖5），增殖4～5 d后長滿皿底。細胞生長曲線顯示，細胞增殖正常（見圖6）。

圖5 成纖維細胞傳代后進行培養

圖6 成纖維細胞的增殖曲線

3 討論

3.1 植塊法培養成纖維細胞

利用組織塊法培養成纖維細胞，是多種動物耳皮膚組織成纖維細胞較理想的培養方法，本試驗采用這種方法成功獲得民豬的耳皮膚組織成纖維細胞。利用組織塊法培養成纖維細胞，不同的研究者報道生長出細胞的時間是不一致的，細胞長出時間與所用方法、培養條件、豬品種和年齡都有關系［5-8］。在培養成纖維細胞的過程中，通常還會有上皮細胞生長，除形態不同外，兩種細胞對胰酶的敏感性不同，在消化過程中利用上皮細胞不容易消化的特性將成纖維細胞和上皮細胞分開，經過2～3次傳代就能將上皮細胞完全剔除。

3.2 組織塊的再利用

利用組織塊培養成纖維細胞，當細胞長滿皿底之后進行消化，通常只收集成纖維細胞，而對于組織塊通常都丟棄了［9-10］。在本試驗中，將組織塊再次植塊培養、進行冷凍后再植塊培養，發現組織塊再培養后仍然能長出細胞，而且長出細胞時間比新鮮組織塊長出細胞時間提前1～2 d。可能的原因是，新鮮組織塊離體后進行培養，需要一個對外部的環境適應的過程；而組織塊再培養時組織塊已經適應了環境，組織塊內的成纖維細胞具備了在培養皿內不斷分裂增殖的特性。利用組織塊的再培養法可以在組織塊數量有限的條件下獲取大量細胞。然而對于組織塊能夠培養利用多少次、組織塊內是否存在皮膚干細胞等問題還需要進一步確認。

3.3 細菌的污染

組織塊法培養成纖維細胞面臨的最大問題就是污染問題［3］。豬的耳組織表面經常和外界環境接觸，尤其是畜舍環境較差時耳組織上會有很多污染源存在。在取樣時如果擦洗、消毒不徹底，常常會導致下一步的細胞污染。前期試驗污染較嚴重，后期要求飼養員采集樣品時徹底擦洗豬耳表面的附著物，同時將PBS 清洗液中雙抗的濃度提高到5%，運回實驗室后刮干凈表面的毛發再進行一次酒精消毒和清洗。經過這樣的處理，組織塊污染的情況幾乎不會發生。另外組織塊再培養過程中沒有發生污染的情況，主要是因為前期經過處理和培養，組織塊是無菌的，繼續在無菌條件下培養就不會發生污染。因此，利用組織塊的再培養不僅可以擴大細胞來源，還可以更好地避免細胞培養中的污染問題。

4 結論

本試驗采用植塊法培養了45頭民豬耳緣組織的成纖維細胞，成功建立了一種組織塊再培養成纖維細胞的培養方法。