透明質酸酶對馬鹿精子體外獲能影響的研究

孫佳陽，崔 凱，馬楊君，鄒 琦，李和平*

（1.東北林業大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱 150040；2.青島農業大學動物科技學院，山東青島 266109）

哺乳動物精子受精前須在雌性動物生殖道內進行獲能，然后才能獲得受精能力，即精子獲能(capacitation)[1-2]。哺乳動物精子獲能現象的發現是動物體外受精研究的里程碑[2]。因而，誘導精子體外獲能技術是體外受精必須首先解決的關鍵技術之一。

透明質酸酶（hyaluronidase）是精子細胞頂體內含有的一種溶酶體酶，它參與溶解含有透明質酸的卵丘，在精子受精過程中起著重要作用[3]。精子頂體位于精子頭部前端，覆蓋在精子核前面，是外包有單位膜的囊狀結構[3]。頂體內含有多種蛋白水解酶、磷酸脂酶等，透明質酸酶便是其中的一種重要酶。當精子獲能、發生頂體反應時，頂體釋放使精子可以穿過卵細胞的放射冠、溶解含有透明質酸的卵丘，使卵泡周圍的顆粒細胞分散，便于精子進入卵子內[2-4]。

馬鹿是目前我國人工養殖的主要特種畜禽之一，探究其受精生物學機制的基礎研究及其相關的體外受精技術具有重要科學意義與實踐價值。但目前有關透明質酸酶對馬鹿精子體外獲能的研究很少。試驗采集馬鹿精子，開展了透明質酸酶對馬鹿精子體外獲能影響的研究，以期為馬鹿體外受精實踐提供基礎的數據參考。

1 材料

1.1 精液來源

成年健康雄性種馬鹿1頭，來自黑龍江省農墾科學院哈爾濱特產所鹿場。以人工采精的方法采得馬鹿新鮮精液，用無卵黃精液稀釋液（Andromed?）稀釋后，在0～4 ℃保存（不超過5 d）。

1.2 試劑與精子體外獲能培養液

透明質酸酶（hyaluronidase），購自SIGMA 公司；其他試劑及精子體外獲能培養液的配制，參照參考文獻[5]。

2 方法

2.1 試驗方案

采用上浮法（sperm swam-up），在精子獲能液透明質酸BO（BO solution）/TALP（臺式液，Tyrode's albumin lactate pyruvate solution）基礎液+6 mg/mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）+10 μg/mL 肝素中，分別添加透明質酸酶至終濃度為0（對照組），0.50，0.75，1.00，1.25，1.50 g/L 的濃度梯度，處理30 min，觀測精子活力、彎尾率以評價體外獲能效果；并隨之制作培養滴于培養箱中培養2，4，6，8 h鏡檢，記錄精子活率。試驗組別設置見表1。

表1 組別設置

2.2 精子活力、活率、彎尾率的檢測

為評價透明質酸酶對馬鹿精子體外獲能效果的影響，在顯微鏡下觀測直線運動精子數、彎尾精子數、活精子數和精子總數，計算精子活力、活率、彎尾率以評價精子質量。直線運動精子數占精子總數百分比為精子活力，活精子數占精子總數百分比為精子活率，彎尾精子數占精子總數百分比為精子彎尾率。精子活力、活率、彎尾率的檢測與計算參照參考文獻[6-7]。

檢測結果以平均值±標準差表示，用t檢驗對數據進行統計分析。

3 結果

3.1 透明質酸酶對精子獲能的影響

3.1.1 BO 液中不同濃度透明質酸酶對精子獲能的作用 添加透明質酸酶0.50，0.75，1.00，1.25 g/L組精子活力均與對照組差異不顯著（P＞0.05），而添加透明質酸酶1.50 g/L 組的精子活力則顯著低于對照組（P＜0.05）。說明精子活力隨著透明質酸酶添加濃度的增加有先增加后降低的趨勢。添加透明質酸酶0.75，1.00，1.25 g/L 組精子彎尾率較高，顯著高于其他組（P＜0.05），且添加透明質酸酶1.00 g/L組的彎尾率最高，見表2。

表2 BO液中不同濃度透明質酸酶對精子體外獲能的影響 %

3.1.2 TALP 液中不同濃度透明質酸酶對精子獲能的作用 透明質酸酶0.50，0.75，1.00 g/L組精子活力均與對照組差異不顯著（P＞0.05），而透明質酸酶1.25，1.50 g/L 組精子活力顯著低于對照組（P＜0.05）。說明精子活力隨著透明質酸酶添加濃度的增加呈降低趨勢。透明質酸酶1.00 g/L 組彎尾率最高，極顯著高于對照組（P＜0.01）；透明質酸酶0.75 ，1.25 g/L 組彎尾率顯著高于對照組（P＜0.05），見表3。

表3 TALP液中不同濃度透明質酸酶對精子體外獲能的影響 %

3.2 時間與透明質酸對精子活率的影響

3.2.1 BO 液中不同濃度透明質酸酶對精子活率的影響 于2，4，6，8 h后鏡檢、記錄精子活率的結果顯示，添加不同濃度透明質酸酶對改善精子活率、延緩精子活率降低沒有效果，見表4。

表4 BO液中不同濃度透明質酸酶對精子活率的影響 %

3.2.2 TALP 液中不同濃度透明質酸對精子活率的影響 于2，4，6，8 h 鏡檢記錄精子活率的結果顯示，添加不同濃度透明質酸酶對精子活率的影響效果、趨勢與在BO 液中的效果相似，即添加不同濃度透明質酸酶對改善精子活率、延緩精子活率降低沒有效果，見表5。

表5 TALP液中透明質酸酶對精子活率的影響 %

4 討論

在2020 年5 月國家公布的《國家畜禽遺傳資源目錄》中的人工養殖的馬鹿是主要特種畜禽之一，對其繁殖技術的研究與實踐無疑具有重要的意義，其中體外受精是實現良種快繁的重要技術領域之一。

精子獲能是哺乳動物精子受精之前必須經歷、不可或缺的一個生理階段[2]，精子獲能是精子進入超激活狀態，涉及精子質膜的脂質組成變化、通透性與流動性提高、內外離子變化等反應[8]。因而在進行體外受精研究與實踐過程中，毫無疑問精子體外獲能就是體外受精的關鍵前提技術。鹿是重要的哺乳類經濟動物，對其開展體外受精等技術的研究同樣具有重要科學意義。但目前對于鹿精子體外獲能、體外受精的研究仍處于起步階段，諸多技術難點有待突破。前期的相關研究已經表明，以TALP、BO、高滲液（high ionic strength medium，HIS）和改良克-林二氏重碳酸鹽溶液（modified Krebs - Ringer bicarbonate solution，mKRB）培養液為基礎液均可使馬鹿精子在體外獲能，而且肝素、咖啡因等也能有效促進馬鹿精子體外獲能，并完成體外受精[9]。

透明質酸酶是一種能夠降低體內透明質酸活性，從而提高組織中液體滲透能力的酶[3]。透明質酸酶是位于精子原生質的水解酶，能夠在受精過程中分解卵子的卵丘，具有水解透明質酸的作用，促使精子能夠順利地穿透卵丘，到達放射冠。透明質酸酶是頂體中固有成分，與受精過程中精子穿透卵子有關[3-4]。因此，在精子獲能培養液中加入透明質酸酶可能有利于精子內透明質酸酶的釋放，加快精子獲能。對牛精子，不論是凍精還是反復洗滌的鮮精，透明質酸酶均能使其活性顯著降低，在使用透明質酸酶后活性是否能恢復到生理值水平、達到改善受精的目的，是很值得探討的問題[4-8]。而且透明質酸酶對精子獲能的頂體反應有協助作用[2-4]。

為了探討透明質酸酶對馬鹿精子體外獲能的誘導作用，本試驗采用上浮法，在獲能液BO/TALP基礎液+6 mg/mL BSA+10 μg/mL 肝素中，分別添加透明質酸酶至終濃度為0，0.50 ，0.75，1.00，1.25，1.50 g/L，測定了精子活力、彎尾率、精子活率等參數指標，以此評價透明質酸酶對馬鹿精子體外獲能的影響。結果表明，在BO 或TALP 液中0.75～1.25 g/L透明質酸酶可提高馬鹿精子體外獲能水平，其適宜的透明質酸酶濃度為1.00 g/L，而在BO或TALP液中添加不同濃度透明質酸酶對改善精子活率、延緩精子活率降低則沒有效果，為今后開展馬鹿精子體外獲能、體外受精等受精生物學相關技術研究提供數據依據。