Sirtuins在精子發生中的表達規律及調控機制研究進展

胡林林，張 青，廖碧云，余金梅，張麗軍，洪齊富，雷小燦,3*

（1.右江民族醫學院附屬醫院生殖中心，廣西 百色 533000；2.遵義醫科大學基礎醫學院，貴州遵義 563003；3.南華大學衡陽醫學院，湖南 衡陽 421001）

精子的發生高度依賴于糖酵解代謝產生的能量，這個復雜的過程被稱為類似腫瘤細胞的Warburg效應，此過程受到代謝傳感器（如Sirtuins）的調控。Sirtuins 是一類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴性脫乙酰基酶，具有高度的保守性，在哺乳動物中主要有7 種，包括SIRT1～SIRT7[1]。Sirtuins 具有獨特的底物特異性和亞細胞定位，參與了多種生物學過程，如基因沉默、細胞周期的調控、代謝、細胞凋亡、癌癥等過程，并與精子發生過程密切相關[2]。研究發現，Sirtuins在睪丸組織中高表達，Sirtuins 的活性與細胞能量狀態以及NAD+濃度和NAD+與NADH 水平之間的波動密切相關，細胞中NADH 的水平主要取決于丙酮酸的去向，以上三個特性決定了Sirtuins在調控睪丸能量代謝的過程中發揮著重要作用[3]，暗示了這些蛋白質對于維持睪丸正常生精功能不可或缺。文章著重從Sirtuins在精子發生過程中的表達規律、功能及相關的調控機制進行綜述。

1 Sirtuins家族分子結構

Sirtuins家族分子的催化核心區域具有高度的相似性：有大小兩個基本結構域，每個結構域由275 個氨基酸殘基組成，大的結構域由Rossmann折疊形成，具有較高的保守性，小的結構域含有一個鋅指結構[4-5]。研究發現，哺乳動物Sirtuins家族7 個亞型（SIRT1～SIRT7）的亞細胞定位不同，其中SIRT2 位于細胞質中，SIRT1、SIRT6 和SIRT7 在細胞核中，SIRT3、SIRT4和SIRT5主要分布在線粒體中[6]。在Sirtuins家族中，SIRT1是研究最多的一種酶，廣泛存在于機體的體細胞和生殖細胞中，主要定位于細胞核的常染色體區。SIRT2 具有催化核心結構部分，這也是Sirtuins家族高度保守的原因之一。SIRT3主要分布在細胞核中，它以257個氨基酸分子（44 kDa）的長鏈形式存在，N端含有一個線粒體靶序列。SIRT4 催化口袋中有一個保守的Ⅱ類區域，它被預測為α區螺旋區，對酶活性具有潛在的重要意義[7]。SIRT5 基因位于6p23，可編碼310，299 個氨基酸的兩種蛋白亞型。鋅離子結構域和Rossmann 折疊域由14 個α 環和9 條β 鏈組成，形成底物和NAD+結合位點[8]。全面了解Sirtuins在睪丸組織中的定位、表達、功能及相關的信號通路，將有助于解決精子發生異常及有效改善精子質量。

2 Sirtuins在精子發生過程表達規律及功能

研究者通過使用不同的方法分析Sirtuins基因在精子發生過程中的表達規律。E.L.Bell 等[9]采用免疫印跡法發現SIRT1在睪丸中呈現高表達；免疫組織化學染色結果顯示，在未分化的A 型精原細胞中未檢測到SIRT1的表達，B型精原細胞及細線前期細胞中可檢測到低水平表達的SIRT1，粗線期、二倍體和減數分裂期生精細胞SIRT1表達量最高。B.Ramatchandirin等[10]首次報道SIRT4在睪丸間質細胞中表達。P.W.Pan 等[11]報道，采用Western Blot 技術和免疫組化技術檢測，SIRT6在睪丸中有表達，并發現SIRT6定位于晚期圓形精子到早期伸長精子的細胞核和成熟精子的頂體中，從而暗示了SIRT6在精子頂體反應中的作用。

最新研究表明，Sirtuins 家族蛋白在男性生殖健康中起著至關重要的作用：（1）Sirtuins在睪丸組織中高表達；（2）Sirtuins 的活性與細胞能量狀態、NAD+濃度和NAD+與NADH 水平之間的波動密切相關；（3）NADH 水平主要取決于丙酮酸是轉化為乳酸還是丙氨酸的過程。這三個特性決定了Sirtuins在調控睪丸精子發生過程起到了重要作用[12]。SIRT1缺失可導致垂體-下丘腦-睪丸軸功能紊亂，使促性腺激素、促卵泡激素和黃體生成素的水平降低、睪酮的合成受阻；雄性小鼠敲除SIRT1后，睪丸重量減輕、精子數量減少、異常精子比例增加、生育力降低[13]。高糖環境可使睪丸中PGC-1α/SIRT3軸發生紊亂，睪丸SIRT3水平降低可導致睪丸線粒體功能受損，睪丸氧化應激增加，精子畸形率增加[14]。

以上這些研究表明，Sirtuins在睪丸組織、生精細胞及成熟精子的頂體中均有高表達，參與性激素水平的調控，可能通過降低線粒體損傷、氧化應激等途徑調控精子的發生及成熟。

3 Sirtuins參與精子發生的可能的調控機制

3.1 Sirtuins對細胞增殖和凋亡的影響

Sirtuins通過NAD+依賴的去乙酰化反應，其活性變化對細胞增殖、凋亡和細胞代謝具有重要調控作用、亦可調控細胞的DNA 修復、氧化應激、衰老等過程[15]。C.Tatone 等[16]研究發現，敲除SIRT1后可使精子在第二次減數分裂前期發生阻滯，精子細胞發生退化或死亡，顯著減少小鼠精子數量，這與睪丸中細胞形態異常、細胞凋亡、DNA損傷密切相關；同時促凋亡基因p53活性的上調可激活細胞的乙酰化作用，抑制SIRT1的表達，從而導致雄性生殖細胞死亡。SIRT3可影響線粒體的功能，如ATP 的產生、活性氧的調節、細胞死亡和生酮作用[17]。SIRT3過表達可增強細胞ATP生成、葡萄糖攝取、糖原形成、乳酸生成，促進胃癌細胞增殖[18]，在SIRT3敲除后p21和Bax的表達顯著升高，Bcl-2的表達降低，導致EC9706細胞的增殖抑制和細胞凋亡[19]。

綜上所述，Sirtuins 在精子發生過程中通過調控凋亡相關基因的表達，來促進細胞增殖，維持睪丸生精細胞形態，減少雄性生殖細胞的死亡。

3.2 Sirtuins對細胞氧化損傷的影響

最近的研究表明，Sirtuins主要通過調節炎癥，氧化應激和線粒體功能而參與衰老相關的各種疾病[20]。Sirtuins 參與調控細胞的氧化應激過程，SIRT1、SIRT3 和SIRT5 可保護細胞不受活性氧（ROS）的影響，SIRT2、SIRT6 和SIRT7 可調控氧化應激的關鍵基因[21]。SIRT1 激活劑可改善細胞線粒體DNA 含量，提高ATP 水平、降低ROS 形成；SIRT2 可通過調控G6PD K403 乙酰化水平來維持還原型輔酶Ⅱ（NADPH）穩態，降低細胞內ROS 水平，從而保護細胞免受氧化損傷[22]。研究表明，AMPK可通過激活SIRT3抑制心肌肥大，改善氧化損傷引發的心臟功能障礙[23]。SIRT4 既可誘導產生活性氧，又具備抗氧化作用，SIRT4 抑制超氧化物歧化酶2（SOD2）與SIRT3的結合，導致乙酰化增加，從而降低了SOD2活性，SIRT4參與并影響脂肪酸的代謝，ROS的生成增加，顯著影響心臟功能[24]。SIRT5敲除后，可導致細胞ROS 水平升高，降低NADPH 水平，清除ROS 能力下降，增加細胞對氧化應激的敏感性[25]。敲除SIRT6的人間充質干細胞中的ROS水平升高，氧化還原代謝紊亂，氧化應激敏感性增強[26]。

綜上所述，Sirtuins 在細胞的氧化應激過程中具有重要調節作用，可以降低細胞內ROS的形成，保護細胞免受氧化應激的損傷，在精子的發生及成熟過程中Sirtuins對氧化應激的調控作用還需進一步研究。

3.3 Sirtuins對信號通路的影響

SIRT1 被認為是PI3K/AKT 通路的負調控因子，它通過去乙酰化腫瘤抑制因子PTEN 及下調AKT和磷酸化水平來抑制膠質母細胞瘤細胞中的PI3K/AKT 通路，白藜蘆醇上調SIRT1水平可以降低PI3K 和AKT 的磷酸化，當HepG2 細胞中SIRT1受到抑制時，PI3K 和AKT 的磷酸化顯著升高[27]。RAO Y.等[28]研究證實，白藜蘆醇可激活SIRT1，SIRT1 進一步激活LKB1/AMPK 通路，即SIRT1 對LKB1/AMPK 通路有正向調控作用。另有研究證明，白藜蘆醇也可增加小鼠脂肪組織和肝臟中NAD+/NADH 比值，提高SIRT1 活性，使LKB1 乙酰化，激活AMPK通路[29-30]。

研究顯示，HL60/A 細胞中shRNA 對SIRT2 的消耗導致多藥耐藥相關蛋白1(mrp1）水平降低，藥物積累增強，并引發更多的凋亡。SIRT2表達下降可顯著下調ERK1/2的磷酸化，而過表達則可引起ERK1/2 磷酸化上調。化學抑制劑PD98059 可以阻斷ERK1/2 的信號通路，進一步誘導SIRT2 耗竭從而引起HL60/A 細胞凋亡，SIRT2的表達水平與DNR/Ara-C 耐藥和ERK1/2 信號通路活性呈正相關[31]。He F.F.等[32]用免疫組化染色和Western blot檢測SIRT2在腎小管間質纖維化（TIF）患者和單側尿道梗阻小鼠中的表達情況，發現SIRT2參與成纖維細胞和TIF 的活化，SIRT2 通過抑制MDM2 信號通路抑制成纖維細胞活化。SIRT3 對自噬的調控是通過激活LKB1-AMPK-mTOR 信號通路實現的[33]。此外也有研究表明，SIRT3 可通過激活SOD2 以減輕ROS 的積累和抑制PI3K/AKT 信號，從而增加TGF-β 和核轉錄因子的易位（Smad）蛋白質[34]。

綜上所述，Sirtuins 在不同類型細胞中通過激活不同的信號通路而發揮作用，Sirtuins 在精子發生過程中的信號通路還需要進一步深入研究。

3.4 Sirtuins對細胞能量代謝的調控

睪丸細胞之間的能量代謝及協同作用是保證正常精子發生的先決條件，睪丸中支持細胞利用葡萄糖通過糖酵解途徑生成丙酮酸，并在乳酸脫氫酶（LDH）的作用下產生乳酸，而乳酸是睪丸中生殖細胞的主要能量來源[35]。研究表明，Sirtuins家族蛋白在調控糖酵解通路具有重要作用，小鼠睪丸支持細胞中AMPK基因特異性缺失可導致能量代謝紊亂，細胞內部乳酸和脂滴集聚，ATP生成減少，同時SIRT1表達降低，小鼠生育力下降[36]。SIRT1缺失下調GLUT1、GAPDH、PKM2、HK2的表達；SIRT1可導致糖酵解的負調控因子p53去乙酰化并失活，保護HIF-1α 不發生乙酰化和降解，增加GLUT1的表達[37-38]。

綜上所述，精子發生依賴于睪丸細胞之間的能量代謝，Sirtuins家族蛋白參與調控糖酵解通路，因此，Sirtuins 對精子的發生及成熟具有重要的調控作用。

4 展望

精子的發生高度依賴于糖酵解代謝產生的能量，在此過程中主要受到代謝傳感器Sirtuins調控，目前Sirtuins 家族在各研究領域已成為研究熱點，已有研究結果顯示SIRT1、SIRT6在睪丸中呈現高表達，SIRT4在睪丸間質細胞中表達，SIRT1的缺乏導致小鼠生精功能障礙、生精細胞數量減少、成熟精子減少、增加了附睪精子的DNA 損傷。但目前Sirtuins 對精子發生的調控機制尚不明確，還需進一步深入研究Sirtuins家族在精子發生過程中的作用機制、調控機制，這對進一步闡明精子發生及相關疾病的診治都有重要的指導意義。