褪黑素對細胞的影響和睪丸支持細胞的調控

馮 瑞，王子銘，李曉宇，鄭 鵬，張貴學

（東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030）

在自然界，褪黑素是一種廣泛存在的分子，由脊椎動物松果腺產生，還在細胞和組織中局部合成，使生物體的生理機能充分適應日常和季節性的需求。褪黑激素具有兩親性，還具有特定的作用機制和作用方式，廣泛在生物體中發揮作用。褪黑素通過自身受體介導的G蛋白信號轉導途徑發揮生理功能，膜受體1和膜受體2實質都是G蛋白，已經在脊椎動物中得到鑒定。文章對褪黑素及其介導的信號通路及睪丸支持細胞的應用進行綜述，以期對后續相關研究和生產提供幫助，奠定基礎。

1 褪黑素

1.1 概述

褪黑素簡稱MT，別稱抑黑素、美拉酮寧以及松果腺素等，是一種由松果腺產生的激素，屬吲哚類，化學式是N-乙酰-5-甲氧基色胺，親脂能力很強，溶于有機溶劑，容易受熱失效。在生物鐘、繁殖、免疫、消化、中樞神經系統、細胞抗凋亡、抗炎、抗氧化以及抗腫瘤方面具有廣泛的生物學效應。褪黑素在不同種生物體內的含量和作用也不同，在動物體內，能使機體皮膚所含色素逐漸變淺，在體內的含量受到光照的影響，由松果腺體細胞分泌出的褪黑素屬于內分泌激素，會進入血液；視網膜受到光照的作用會通過下丘腦影響褪黑素的分泌；褪黑素通過分布于不同部位的膜受體來調節血壓、性行為、生殖活動、季節性繁殖調節、晝夜節律和入睡覺醒時間。褪黑素發揮作用大部分是通過激活受體及直接接觸的作用[1-3]。

在1917年研究人員發現從牛的松果腺提取出的物質作用于蝌蚪，減淡了皮膚顏色，在1959年分離并鑒定出褪黑素。早先人們認為褪黑素是動物神經激素，直到1987 年在植物中提取出相同結構的物質，由此得知線粒體或葉綠體都能產生褪黑素[4-5]。

1.2 功能

褪黑素可以穿過細胞膜和核膜，作用于細胞。其主要功能：作用于生殖細胞、下丘腦和垂體、調節激素分泌和精子卵子發生；可以預防癌癥的發展，如乳腺癌；通過刺激谷胱甘肽（GSH）的產生，從而調節H2O2酶的合成，清除活性氧（ROS），改善線粒體的質量，達到抗氧化作用；通過受體結合調節免疫器官和免疫細胞發揮抗炎作用；可以與核受體維甲酸受體/維甲酸Z 受體(ROR/RZR)家族結合，參與晝夜節律的調節；有防治腫瘤、促進損傷修復等重要功能；可以對其他激素進行直接或者間接的分泌調節，如卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）等；可以結合G蛋白偶聯的膜受體（MT1和MT2）通過多種信號轉導途徑激活相應的信號通路，調控細胞相應的生理活動[6-8]。

1.3 受體

褪黑素受體的種類已經明確，有兩類受體：核受體和膜受體。核受體包括RZR 和ROR，膜受體包括膜受體1（MT1）、膜受體2（MT2）和膜受體3（MT3）。MT1 和MT2 實質是G 蛋白，具有高親和力，發揮作用時G蛋白發生偶聯；MT3主要存在于非哺乳動物體內，在人體細胞中沒有發現MT3 受體的存在，在倉鼠的肝臟、腎臟中有發現。研究表明，MT1存在于視網膜、生殖系統、乳腺、肝臟和腎臟等。在不同組織和細胞中MT1、MT2 和MT3 受體介導的信號通路有所不同[9-13]。

1.4 合成

褪黑素體內或體外合成受到的影響因素有很多，最重要的是光照，白天光照充足分泌減少，夜晚光照缺少則分泌增多。在此過程中，松果腺釋放去甲腎上腺素，調節褪黑素的增多或者減少。另外，睪丸也能夠合成褪黑激素。

1.4.1 體內合成褪黑素的途徑 首先，松果腺體細胞從血液中吸取色氨酸。

其次，來自血液中的色氨酸經過色氨酸羥化酶（TPH）催化轉化為5-羥色氨酸，后被磷酸吡哆醛和磷酸二甲酯脫羧產生5-羥色胺（即血清素），通過芳基烷基胺N-乙酰轉移酶（AANAT）轉化為N-乙酰血清素。

最后由O-甲基轉移酶（ASMT）催化形成褪黑素，釋放到松果腺的毛細血管中，并以更高的濃度進入腦脊液，然后運輸到機體所需部位[4,15]。

1.4.2 體外合成褪黑素途徑 體外可以由色氨酸通過一個簡單的四步合成途徑合成褪黑素，關鍵是需要足夠的色氨酸。

第一步：同體內合成第一步一致；

第二步：5-HTP 由芳族氨基酸脫羧酶（AAD）被催化為5-羥色胺（5-HT）；

第三步：通過N-乙酰轉移酶（NAT）使血清素（5-羥色胺）被乙酰化；

第四步：通過羥基吲哚-O-甲基轉移酶（ASMT）催化羥基甲基化轉化為褪黑素。

2 褪黑素對細胞的調控

2.1 增殖分化調控

褪黑素通過受體介導信號通路促進細胞的增殖分化調控。褪黑素可以介導Wnt/β-catenin信號通路、mTOR信號通路和MAPK信號通路[16]。

Wnt/β-catenin信號通路激活后參與調控細胞的增殖分化，主要是MT2發揮作用。c-myc是一種可使細胞大量增殖和促進細胞分化的基因，也是該信號通路直接作用的下游靶基因。MT2抑制糖原合酶3磷酸化，使β-鏈蛋白聚集到一定程度，濃度會逐漸增加，此時會向細胞核內轉移并與轉錄因子結合，促進c-myc轉錄，達到調控細胞增殖分化的目的[17-18]。

mTOR 信號通路中最重要的是雷帕霉素靶蛋白，它是一種保守的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，復合物有兩種，分別是mTORC1 和mTORC2。活化后的mTOR 在細胞增殖、分化及代謝等方面發揮關鍵的調控作用。激活PI3K/Akt/m TOR信號通路會促進細胞增殖分化，這是一個主要途徑[19-20]。

MAPK信號通路參與很多調控，如增殖、應激、生長、發育、分裂、炎癥等，屬于酶級聯反應。調控細胞增殖分化主要是通過胞外調節蛋白激酶（ERK）發揮作用。

2.2 抗凋亡調控

在細胞中，細胞凋亡是一種主動進行的程序化死亡，是正常增殖分化的細胞受到某些基因的調控導致。

細胞凋亡存在內外兩種途徑，細胞內途徑是通過線粒體凋亡途徑調控，細胞外途徑是通過細胞死亡受體介導的途徑調控。這兩種途徑最后都會由半胱天冬氨酸蛋白酶家族的激活而促進凋亡基因轉錄和翻譯，從而調控細胞凋亡[21]。

褪黑素可以介導胞內和胞外信號通路，緩解細胞凋亡。

2.2.1 細胞外途徑 外源性凋亡途徑是通過啟動依賴Caspase酶級聯反應的細胞凋亡過程，是一種通過蛋白互作的信號通路，直接調控細胞凋亡。腫瘤壞死因子受體是死亡受體，存在一種結構域，實質上是死亡結構域，它能與配體特定結合，激活凋亡信號通路，如Fas/Fas L[22]。

信號通路激活以后，Fas 受體活化，并快速與細胞質中相關的死亡結構域蛋白結合，這類蛋白既能與Fsa 相結合，也可以聚集半胱天冬酶8 酶原，形成“Fas受體-死亡結構域蛋白-半胱天冬酶8酶原”結合體，當大量的結合體聚集，導致局部濃度上升，此時半胱天冬酶8酶原會在復合體中催化形成具有活性的半胱天冬酶8，迅速激活下游因子，啟動酶級聯反應，調控細胞凋亡。

褪黑素作用以后，Fas 和Fas L 基因表達量顯著下調，“Fas受體-死亡結構域蛋白-半胱天冬酶8酶原”結合體形成減少，同時凋亡蛋白表達也降低，膜通透性改變，線粒體細胞色素C 釋放減少。這種調控還會抑制下游Caspase家族因子的激活。綜上所述，褪黑素抑制Fas/Fas L 信號活性和Caspase家族蛋白的表達[23]。

2.2.2 細胞內途徑 細胞在機體中也會受到很多不利的刺激，如機體內缺氧、新陳代謝紊亂、凋亡基因激活、DNA受損等，這些因素會直接影響細胞穩態，導致線粒體損傷、膜電位失衡、通透性改變和凋亡因子產生，最終激活線粒體凋亡途徑[21,24]。

細胞內最主要的凋亡途徑就是線粒體凋亡。當線粒體凋亡途徑被激活時，通過調節凋亡蛋白翻譯和基因轉錄發揮作用，控制線粒體膜的通透性，最終調節線粒體細胞色素C的釋放。

線粒體基質可以合成褪黑素，外源補充的褪黑素也會集中在線粒體中。褪黑素可刺激抗氧化酶，使沉默調節蛋白3（SIRT3）水平升高。外源性褪黑素會通過寡肽轉運蛋白進入線粒體，通過影響解偶聯蛋白（UCP）影響線粒體膜電位。而且基質中的褪黑素可能會從線粒體中泄漏出來，與受體相互作用，控制細胞色素C的釋放，減少促凋亡蛋白的表達，保證DNA 分裂正常，減少細胞的凋亡[25-26]。

2.3 抗氧化調控

在哺乳動物細胞中，內源性的ROS 主要來源是線粒體，ROS通過線粒體電子傳輸鏈不斷生成，在正常的生理條件下內源性抗氧化劑（如GSH）清除ROS，以維持氧化穩態。由于細胞中ROS 含量不平衡而產生氧化應激，褪黑素可以保護線粒體正常工作和完整性，抑制ROS 的產生，維持穩態，減少氧化應激發生。

褪黑素對生理或壓力相關條件下線粒體損傷和ROS 產生的影響具有積極作用，在生理條件下褪黑激素通過受體的結合或與信號調節因子相互作用，短暫刺激少量ROS的產生，以維持參與該激素的合成代謝。

由于快速的新陳代謝或衰老給予細胞壓力，褪黑素通過保護膜電位和ATP水平防止線粒體損傷。以這種方式，褪黑激素限制ROS的量，使其維持在與最佳控制穩態過程相適應的水平，達到抗氧化作用。褪黑素緩解氧化應激的通路不止一條，還有如ERK、MAPK/JNK和Nrf2/HO-1等[27-30]。

2.4 抗炎調控

褪黑素可刺激酪氨酸磷酸酶活性并降低絲裂原活化蛋白激酶、ERK、p38和JNK的磷酸化水平，抑制NFκB和MAPK信號通路的激活，維持細胞內抗炎因子和促炎因子的表達量，在細胞炎癥的調節中發揮作用。

3 褪黑素對睪丸支持細胞的調控

3.1 增殖分化調控

褪黑素可以通過ERK信號通路調控睪丸支持細胞增殖分化。研究發現，加入1a000 nmol/L褪黑素處理48 h 后可激活ERK/抑制素α 亞基信號通路，ERK 的磷酸化水平上升，顯著提升細胞活力，促進雞睪丸支持細胞增殖；模擬體內環境條件下，在體外將褪黑素和離體山羊睪丸支持細胞共培養，使細胞外調節蛋白激酶（ERK）的磷酸化水平升高，產生較多膠質細胞源性的神經營養因子（GDNF），促進睪丸支持細胞增殖[31-32]。

3.2 抗氧化調控

褪黑素可以通過Nrf2/HO-1 信號通路調控對睪丸支持細胞氧化應激。研究表明，褪黑素可以有效緩解熱應激導致的睪丸支持細胞氧化應激損傷，并恢復間隙連接和緊密連接[33]；在順鉑誘導小鼠睪丸支持細胞氧化損傷時，丙二醛含量明顯增多，超氧化物歧化酶（SOD）、GSH 和過氧化氫酶（CAT）等指標顯著下調。加入褪黑素以后，Nrf2/HO-1通路上的Nrf2、HO-1蛋白明顯上調，解除順鉑對信號通路蛋白抑制作用，氧化應激指標恢復正常，這充分說明了褪黑素是抗氧化的良好治療物[34]。

3.3 抗炎癥調控

褪黑素可以通過NFκB 信號通路調控炎癥反應，抑制細胞中促炎細胞因子IL-6、TNFα和IL-1β的表達。研究發現，DEHP 會使細胞NFκB 核易位，使炎癥因子IL-1β和TNF-α 表達量顯著上調，誘導炎癥反應，通過加入褪黑激素可有效降低DEHP 誘導小鼠睪丸的炎癥反應。由此可以看出褪黑素可用作減少雄性生殖系統內分泌破壞性化學物質的治療藥物[33]。

4 展望及總結

睪丸支持細胞是睪丸內非常重要的體細胞，對于繁殖非常有意義。大量研究已經表明，褪黑素對于其他細胞在各個方面有積極作用，但在睪丸支持細胞上的研究少之又少。通過以上綜述來看，研究褪黑素對細胞增殖分化、抗凋亡、抗炎以及抗氧化是非常有意義的，褪黑素對生殖相關細胞方面的研究還有待探索，尤其在信號通路方面和其他外源物質相互作用方面，可能不僅僅只存在一種信號通路發揮作用，多條通路關聯或者相互調控；不同物種間存在相同或者不同的信號通路促進生殖相關細胞增殖分化、抗凋亡、抗炎以及抗氧化。褪黑素在精子的產生、成熟、運動、品質、疾病和生殖相關內分泌有著不可忽視的作用?？傮w而言，研究表明褪黑素對睪丸功能和雄性生殖有重要影響，隨著研究的深入，褪黑素的作用機制會更加深入完善，將會為畜牧生產實踐中褪黑素的應用提供堅實的理論依據和基礎。