基因工程玉米Bt799對大鼠胚胎中腦細胞微團及腭板發育的影響

侯超 郭倩穎 劉欣然 劉思奇 麻慧娟 劉珊 王軍波

基因工程技術應用于新品種作物栽培已有近40年歷史，該技術為人類應對糧食短缺和農作物病蟲害提供了有效途徑[1]。1993年轉入Bt(Bacillus thuringiensis)基因的抗蟲玉米研發問世，抗蟲玉米的應用解決了玉米螟對作物的啃食問題，減少了抗蟲農藥使用量，在保護環境和提高經濟收益方面產生了積極影響[2]。然而，近年來，基因工程作物食用安全性問題存在爭議[1-4]。對基因工程作物開展研究可以考察其食用安全性，并為進一步應用提供依據。歐洲替代方法驗證中心(European Center for Validation of Alternative Methods, ECVAM)推薦的胚胎細胞微團培養試驗為有效性較高的體外胚胎毒性發育試驗[5]，腭板培養也是研究受試物對實驗動物發育影響和機理的主要手段[6]。因此，本研究通過大鼠中腦細胞微團培養和腭板培養兩種方法，對基因工程玉米Bt799及目的蛋白Cry1Ac進行了發育毒性研究，為基因工程作物食用安全性評價提供了實驗參考依據。

材料與方法

一、受試物

Cry1Ac蛋白凍干粉(95%～98%)(Laboratory of Biochemistry Dept，School of Medicine, Case Western Reserve University)，基因工程玉米Bt799(中國農業大學)。Bt799玉米轉入了Cry1Ac基因，各部位可穩定表達Cry1Ac蛋白，種子中Cry1Ac蛋白表達量為(130.0±1.3)ng/g(n=3)。親本玉米鄭58種子中未檢測到Cry1Ac蛋白。兩種玉米主要營養成分見表1。

表1 Bt799玉米和鄭58玉米主要營養成分對比(mean±SD, n=3, g/100 g)

二、實驗動物

SPF級健康未生育雌性Wistar大鼠，9周齡，體重(200±20)g；SPF級健康未生育雄性Wistar大鼠，9周齡，體重(300±20)g。大鼠按雌雄比1∶1于18:00合籠并于次日8:00檢查陰栓，以查見陰栓之日為孕0 d。雌鼠全部受孕后，使用加工飼料按照分組喂養雄鼠并制備即刻離心血清(immediate centrifugation serum, ICS)，制備后使用ELISA試劑盒檢測ICS中Cry1Ac蛋白含量。雌鼠用于提取胚胎中腦細胞和胚胎腭板。實驗用大鼠購自北京大學醫學部實驗動物中心(動物合格證號：SCXK11-00-0004；實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2006-0025；實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2006-0008)。飼養于北京大學醫學部實驗動物部(動物實驗環境設施(SPF)合格證書：醫動字第01-2055)。環境溫度范圍：(25±1)℃，相對濕度范圍：50%～60% RH，室內照明：12 h:12 h明暗交替。單籠飼養，自由飲水進食。動物喂養及實驗操作嚴格按照《北京市實驗動物管理條例》執行。

三、主要試劑

雙酚A(美國Sigma公司)，0.1%中性紅(美國Amresco公司)，蘇木精(美國Sigma公司)，全反式視黃酸(all-trans retinoic acid，ATRA)(美國Sigma公司)，BGjb標準培養基(美國Gibco公司)，二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)(美國Hyclone公司)，Bt-Cry1Ac-ELISA試劑盒(美國Agdia公司)。

四、主要儀器

恒溫旋轉培養裝置(金壇區金城致杰實驗儀器廠)，混合供氣系統(雷蒙特科學實驗室設備有限公司)，超凈工作臺(北京半導體設備一廠)，體視顯微鏡(北京西沖科技發展有限公司)，酶標儀(美國分子儀器公司)。

五、中腦細胞微團培養實驗

1.中腦細胞提取方法：于孕13 d時脫頸處死孕鼠并消毒，無菌艙中剖腹取出子宮分離胚胎。體視顯微鏡下選擇處于34～36體節數時期的胚胎，分離胚胎中腦組織，將中腦組織于37 ℃下以PBS沖洗三次后孵育20 min，棄去PBS以適量0.5%胰蛋白酶消化10 min。加入Ham′s F12完全培養液終止消化并連續沖洗三次。于適量Ham′s F12培養液中吹吸打散組織塊，200目篩過濾得到單細胞懸液后計數細胞，將所提取細胞的細胞密度調整到5×109/L，接種于24孔板或96孔板中，分別進行細胞分化與增殖觀察。

2.實驗分組與劑量設計：中腦細胞微團培養分八個組進行，分別對應表2中描述的八種不同培養環境。將制備ICS的Wistar大鼠隨機分為六組，其中NM(Naturel Parent:親本對照)組、TM3(Time 3 Days:干預3天)組、TM1M(Time 1 Month:干預1個月)組、TM3M(Time 3 Days:干預3個月)組、PCB(Positive Control B:陽性對照B)組為前五組大鼠，BP(Bt Protein:Bt蛋白組)組、BC(Black Control:空白對照組)組、PCA(Positive Control A:陽性對照A)組因大鼠未經直接干預且不影響組間比較，故共同使用第六組大鼠的血清。在上述分組中NM組、TM3組、TM1M組、TM3M組使用添加玉米樣本的加工飼料。以玉米所含淀粉完全替代AIN-93G標準飼料中碳水化合物，由此計算出玉米最大可添加量為84.7%。飼料制作確保主要營養成分構成不變，蛋白質不足部分以酪蛋白補充。BP組Cry1Ac蛋白的添加量為依照飼料中玉米添加量、Bt799玉米種子中Cry1Ac蛋白含量、大鼠飼料攝入量計算所得的最大可能暴露劑量。于雌鼠孕13 d獲得胚胎中腦細胞，不同條件下進行細胞增殖和分化觀察，分組與干預方式如表2。

3.蘇木精染色法觀察中腦細胞分化情況：吸取20 μL細胞懸液加入24孔板，按照表2中分組描述進行干預，每個劑量組設10個平行樣。細胞于37 ℃條件下貼壁2 h。CO2培養箱中連續培養中腦細胞5 d，然后吸去培養基，10%甲醛固定20 min，棄甲醛并以蘇木精染色1～3 min，去離子水洗去染液靜置返藍15 min后風干。顯微鏡下計數著色集落，根據中腦細胞集落數量確定細胞分化情況。集落分化百分比(%)=實驗組集落數/溶劑對照組集落數×100%。

4.中性紅攝取法觀察中腦細胞增殖情況：吸取10 μL細胞懸液加入96孔板，按照表2中分組描述進行干預，每個劑量組設10個平行樣。細胞于37 ℃條件下貼壁2 h。CO2培養箱中連續培養中腦細胞5 d。棄去培養基，于戊二醛中固定中腦細胞20 min，隨后以生理鹽水清洗三次。于0.05%中性紅溶液中室溫孵育30 min，棄去中性紅并以生理鹽水清洗三次，再以50%甲醛提取2 h。使用分光光度計于550 nm波長處測量吸光度值(A)，并根據吸光度值判斷細胞增殖情況。細胞存活率(%)=A實驗組/A溶劑對照組×100%。

表2 大鼠胚胎中腦細胞微團培養分組與干預方式

六、腭板培養方法

1.腭板的體外旋轉培養：孕12.5 d(以妊娠第12.5 d的14:00為準)時脫頸處死雌鼠并消毒，于無菌艙中分離胚胎，以眼科剪將胚胎順口凹與眼水平線剪下顱面中部。以解剖刀沿腭板下沿水平切去后腦組織、舌頭及下腭，保留腭板。將9 mL的BGjb培養液(37 ℃預溫)加入50 mL培養瓶中并向培養液中加入對應受試物，用吸管將腭板轉移入培養瓶，培養密度每瓶3～4個。于旋轉培養箱中以不同分組條件連續培養腭板72 h(37 ℃，25 r/min)。分別于培養第0 h、24 h、48 h向培養瓶充入無菌過濾混合氣體2.5 min，混合氣體體積比為50:5:45(O2:CO2:N2)。

2.實驗分組：于恒溫旋轉培養箱中依照表3進行72 h腭板連續培養。分組與干預如表3。

表3 大鼠胚胎腭板旋轉培養分組與干預方式

3.腭板培養評分：腭板融合情況分5個類型，即(1)雙側腭突仍分離計為1分；(2)雙側腭突靠近但未接觸計為2分；(3)雙側腭突接觸但未融合計為3分；(4)雙側腭突部分融合(后部軟腭融合)計為4分；(5)雙側腭突完全融合(融合長度>1/2中線長度)計為5分。每只腭板根據上述分類情況計分，并計算融合率(融合率=計分為4分和5分的腭板數/總腭板數)。

七、統計學處理

計量資料采用均數±標準差的形式表示。采用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，行方差齊性檢驗，方差齊時組間比較使用單因素方差分析、Tukey′s事后兩兩比較檢驗；方差不齊數據采用Kruskal-Wallis H非參數檢驗，并用Dunnett ′s進行組間比較。計數資料采用卡方檢驗。P<0.05認為差異有統計學意義。

結 果

一、Cry1Ac蛋白及不同ICS對大鼠胚胎中腦細胞增殖分化的影響

如表4所示，TM3組、TM1M組、TM3M組和BP組中腦細胞增殖率略低于BC組和NM組，但差異無統計學意義。TM3M組細胞分化率低于BC組和NM組，但差異無統計學意義，其他各組細胞分化率均未同時低于BC組和NM組。PCA組和PCB組細胞增殖與集落分化率都明顯減少，與NM組、BC組相比差異均有統計學意義。TM3組、TM1M組、TM3M組、BP組之間細胞增殖率和細胞分化率差異均無統計學意義。

表4 Cry1Ac蛋白、雙酚A和不同ICS對大鼠胚胎中腦細胞增殖與分化的影響(mean±SD, n=10)

二、Cry1Ac蛋白對大鼠胚胎腭板形態的影響

如圖1-A和圖1-B所示，BC組和BP組多數腭板正常融合；如圖1-C所示，RA組可見較多雙側腭突未接觸的腭板。如表5所示，BP組腭板融合率與BC組相比差異無統計學意義；RA組腭板融合率與BC組相比明顯降低，差異具有統計學意義。

A:Fused palate of BP group; B:Fused palate of BC group; C:Palatal plate without fusion of RA group

表5 Cry1Ac蛋白與全反式視黃酸對Wistar大鼠胚胎腭板融合率的影響

三、大鼠血清中Cry1Ac蛋白的含量

按照分組使用加工飼料分別喂養大鼠3 d、1個月、3個月后，所制備ICS中Cry1Ac蛋白含量接近，TM3、TM1M、TM3M組間結果兩兩比較，差異無統計學意義，MN、BC組大鼠ICS中未檢出Cry1Ac蛋白(檢測限>0.01μg/L)。TM3、TM1M、TM3M組結果與BC、NM組相比，差異具有統計學意義。

表6 Bt799玉米喂養不同時間后各組大鼠ICS中Cry1Ac蛋白含量(mean±SD, n=8)

討 論

本研究通過微團培養和腭板培養兩種方法，參照食品安全國家標準生殖發育毒性實驗(GB 15193.25-2014)對基因工程玉米Bt799及其目的蛋白Cry1Ac進行了發育毒性研究。為了判斷飼喂Bt799玉米是否會導致大鼠血清中出現Cry1Ac蛋白，并研究血清中存在Cry1Ac蛋白情況下可能帶來的進一步影響，本研究在微團培養中采用經Bt799玉米喂養大鼠的ICS進行實驗。與此同時設立BP組，使用Cry1Ac蛋白對胚胎中腦細胞進行干預，通過兩種暴露途徑共同探究了基因工程玉米Bt799及Cry1Ac蛋白發育毒性的可能性。本研究結果顯示，TM3組和BP組細胞增殖率都與BC組和NM組有細微差異，而TM3組血清是存在Cry1Ac蛋白的，提示Cry1Ac蛋白可能對中腦細胞增殖產生了輕微影響。但因整體食物與食物中主要成分無法等價，食物中特定物質的影響也不能代表整體食物的影響，故存在Bt799玉米本身對中腦細胞增殖產生影響的可能性。本研究結果發現，Bt799玉米與已具備足夠安全性的親本對照鄭58玉米相比不具備更高危險性；此外BP組與BC組相比細胞增殖率、分化率無明顯差異，表明Cry1Ac蛋白未產生不良影響，進一步驗證了Bt799玉米的安全性。已有研究證實雙酚A具有發育毒性[7]，其可能機制是通過影響Notch-Hes通路，增加了Notch1和Hes1 mRNA的表達水平[8]。李勇等[6]研究發現雙酚A為陽性致畸物，在40 mg/L的暴露劑量下對中腦細胞微團培養存在不良影響。本研究發現PCA組細胞增殖率與分化率明顯低于BC組，這與既往研究結果一致，并與TM3組的結果形成陽性對照，表明Bt799玉米與雙酚A相比安全性較高。PCB組細胞增殖率與分化率明顯低于BC組，這與既往研究結果一致，并與BP組的結果形成陽性對照，表明Cry1Ac蛋白與雙酚A相比安全性較高。但考慮到雙酚A的化學結構與Cry1Ac蛋白相比差距較大。建議在后續實驗中，進一步以蛋白質類致畸物作為陽性對照，以提高實驗結果的準確性。

以上研究結果表明在最大可添加劑量下，Bt799玉米和Cry1Ac蛋白均不會對大鼠胚胎中腦細胞的增殖與分化產生影響。Flint[9]認為受試物的半數分化抑制濃度在10 μg/mL以下時為強致畸物，在100 μg/mL以上時無致畸作用。本研究中Cry1Ac蛋白添加劑量為5.2 mg/L，此劑量下Cry1Ac蛋白未對大鼠中腦細胞增殖與分化產生影響。在后續研究中應設置更高劑量梯度，計算Cry1Ac蛋白的半數分化抑制濃度和半數增殖抑制濃度，從而判定Cry1Ac蛋白的致畸性。從實際暴露的角度出發，Cry1Ac蛋白的唯一暴露途徑為通過基因工程作物經口攝入，暴露水平不會高于5.2 mg/L，與此同時Cry1Ac蛋白檢測結果提示喂養不同時長后大鼠ICS中Cry1Ac蛋白含量無明顯差異，提示Cry1Ac蛋白未表現出蓄積性，進一步說明不存在暴露水平高于5.2 mg/L的可能性。因此，探索Cry1Ac蛋白的半數分化抑制濃度和半數增殖抑制濃度僅可作為Cry1Ac蛋白研究的補充，但不具備較高食品安全評價價值。TM3組、TM1M組、TM3M組細胞增殖率、分化率與BC組、NM相比均無明顯差異，表明在最大可添加量下，飼喂Bt799玉米三個月不會對大鼠胚胎中腦細胞活動產生不良影響，喂養時長不是可能導致不良結果的主要因素。本研究里ICS中Cry1Ac蛋白檢測結果表明，使用含Bt799玉米的加工飼料喂養大鼠可導致Cry1Ac蛋白在血清中的存在，這提示親代大鼠攝入Bt799玉米后，其胎仔存在暴露于Cry1Ac蛋白的可能性；但血清中可檢測到Cry1Ac蛋白的具體原因尚不明確，有待進一步實驗確認。與此同時，本次研究所用ICS均來自雄鼠，所測結果可能與雌鼠羊水中Cry1Ac濃度存在差異，建議在后續研究中，同時檢測雌鼠孕期血清與羊水中Cry1Ac蛋白濃度，明確該蛋白通過胎盤屏障的可能性。大鼠胎仔生物結構尚未發育完全，血腦屏障是否能阻斷Cry1Ac蛋白的通過存在不確定性，故在后續研究中建議檢測大鼠胎仔大腦中Cry1Ac蛋白含量，判斷該蛋白通過血腦屏障的可能性。

腭板培養是判斷物質致畸性的常用方法[10]。Shiota等[11]認為血清中含有不確定物質，不利于體外環境的控制。本研究采用無血清的標準BGjb培養液作為腭板培養基，排除了血清對實驗的影響。本研究結果顯示，RA組腭板融合率顯著低于BC組，表明ATRA在本研究所用劑量下會顯著影響腭板融合，這與Han等[12]的研究結果一致。并與BP組形成陽性對照，表明在最大可能暴露劑量下，Cry1Ac蛋白對大鼠腭板融合無不良影響。

本研究結果表明，在最大可能暴露劑量下，Bt799玉米和目的蛋白Cry1Ac均不具備發育毒性。Guo等[13]使用Bt799玉米喂養雄性大鼠13周，未發現該玉米對大鼠健康狀況和生殖系統的不良影響。Hu等[14]使用可表達Cry1Ac蛋白的基因工程大米對大鼠進行連續三代的喂養，除觀察到一些血液學指標變化外未觀察到其他不良改變。總體而言，Bt799玉米是安全的。對Cry1Ac蛋白的安全性研究可作為基因工程作物食用安全性的證據[15]，但目前Cry1Ac蛋白的安全性尚無定論。Santos-Vigil等[16]通過灌胃Cry1Ac蛋白的方式對大鼠進行干預，發現該蛋白具有腸道致敏性。Torres-Martínez等[17]研究發現Cry1Ac蛋白可影響大鼠巨噬細胞的活動，通過NAPK和NF-κB途徑誘導巨噬細胞的活化。所以圍繞Cry1Ac蛋白的研究依然具有實際價值。但受毒理學資料不足以及最大可添加劑量的限制，目前只能在一定限度內說明Cry1Ac蛋白對大鼠胚胎發育的安全性，而對Cry1Ac蛋白是否屬于致畸物這一問題的判斷需要毒理學研究的補充。

國內目前對基因工程作物的態度為應以實質等同性原則為基礎并綜合采納其他方法開展研究，其中也包括危險性評價和個案處理原則[18]。本研究使用體外實驗替代了整體動物實驗，一方面降低了對實驗動物的傷害，另一方面在體外獲得了更加直觀的結果。同時也從新的角度針對基因工程作物展開了研究，為后續研究提供了新的數據與方法參考。此外，目前國內外圍繞基因工程作物的研究多為整體動物實驗。體外研究較少且評價方法單一，分子水平研究的報道較少[19]。因此，后續應在目前研究的基礎上，更加深入地探討基因工程作物的安全性，最大限度保證基因工程作物在實際應用中的安全性。

綜上所述，本研究未觀察到Bt799玉米及其表達蛋白Cry1Ac對大鼠胚胎中腦細胞和腭板發育的不良影響。