染色體核型分析后剩余羊水標本檢測胎兒耳聾基因可行性探析

藺姝祺 趙琦 曹慧 楊宇 趙曉曦

耳聾是嚴重影響人類健康和生活質量的疾病之一，遺傳因素在其發病中占有重要位置。大約 80%遺傳性耳聾為非綜合征型[1]。近期，國內開展的大規模耳聾分子流行病學研究表明，相當一部分非綜合征性耳聾由為數不多的幾個基因引起，如 GJB2 基因、SLC26A4 基因、12SrRNA基因以及GJB3 基因等[2]。

目前，國內一些地方已開展利用遺傳性耳聾基因檢測試劑盒，對新生兒進行耳聾基因篩查[3]，這一工作對于早期發現患者和攜帶者有重要意義。但新生兒篩查是在孩子出生后進行的檢查，聾兒出生后沒有根治的方法，只能是對癥治療，對預防聾兒出生并沒有起到真正作用。

市場上常用的遺傳性耳聾基因檢測試劑盒，主要是針對GJB2 基因、SLC26A4 基因、12SrRNA基因、GJB3 基因進行檢測。

臨床上抽取羊水主要是為了診斷胎兒的染色體病。為了使羊水細胞生長的更旺盛，通常在收獲羊水細胞前需要更換培養基，為了防止在制備染色體核型標本中發生失敗，通常將換液時舊培養基放在另一培養瓶中培養，等胎兒染色體分析完成后，這個培養物通常被廢棄。那么是否可以利用這部分羊水細胞進行胎兒耳聾基因檢測是本研究所要探討的問題。如果能夠利用這部分羊水細胞進行胎兒耳聾基因的檢測，對于防止耳聾患兒出生，早期發現耳聾基因攜帶者將起重要作用，而且對于充分利用胎兒遺傳物質對胎兒遺傳病篩查和診斷將有重要意義。

對象和方法

1.對象：選取2019年6月至2019年7月間在內蒙古醫科大學附屬醫院婦產科進行羊水穿刺查胎兒染色體孕婦作為研究對象。入組標準為因母體血清篩查高風險和高齡孕婦(年齡大于35歲患者)，且無明顯其他疾病史，胎兒染色體核型正常；排除標準為胎兒超聲異常，或有明顯遺傳病病史的孕婦。

2.羊水細胞的收集：用吸管輕輕刮出培養瓶上的羊水細胞，將其與培養液一起吸入離心管，1 500轉/5分鐘離心。

3.羊水細胞DNA提取和含量檢測：選用深圳亞能生物科技有限公司提供的DNA試劑盒，按照試劑盒使用說明進行操作提取羊水標本中DNA，用分光光度法檢測標本DNA含量。

選用深圳亞能生物科技有限公司生產的遺傳性耳聾基因檢測試劑盒，按照試劑盒使用說明進行操作。通過對DNA的擴增、雜交顯色，判斷待測標本是否存在耳聾相關的基因的突變。

該試劑盒主要檢測4個常見的遺傳性耳聾基因的16個突變位點，包括GJB2基因的四個突變位點(35del G、176-191del 16、235del C、299-300del AT)，GJB3基因的兩個突變位點(538C>T、547G>A)，SLC26A4基因的八個突變位點(IVS7-2A>G、2168A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T)，12SrRNA基因的兩個位點(1494C>T、1555A>G)，通過DNA反向雜交位點顯色，判斷相應位點的突變情況。圖1顯示在模條上各基因位點的位置。

圖1 耳聾基因檢測模條各基因位點圖

結果

1.羊水標本的DNA含量：16個羊水DNA標本含量見表1，標本8沒有提取到足夠DNA。

表1 16個羊水DNA標本含量

2.耳聾基因的檢測結果：對15個羊水標本和1個已知遺傳性耳聾基因攜帶者外周血標本進行檢測，16個標本均可顯示清晰的雜交斑點。在15個羊水標本中，6號標本為GJB2 基因突變(235del C突變)雜合子。結果見圖2。

圖2 6號標本的遺傳性耳聾基因檢測結果

討論

本研究結果顯示，利用染色體核型分析后剩余羊水標本可以提取足夠的DNA進行耳聾基因檢測。這一研究結果對于以后開發和利用染色體核型分析后剩余羊水標本對胎兒遺傳病進行篩查和診斷有重要意義。

GJB2基因，常染色體隱性遺傳。GJB2 基因突變主要導致先天性非綜合征性耳聾。GJB2基因的編碼產物Cx26蛋白對維持耳內正常滲透壓和聽覺生理有著極其重要的作用[4]。GJB2基因的致聾機制主要是各種突變所致的Cx26結構和定位異常，從而導致蛋白通道的功能異常[4]。

SLC26A4基因，常染色體隱性遺傳。SLC26A4 基因與大前庭水管綜合征(enlarged vestibular aqueduct syndrome,EVAS)和Pendred氏綜合征密切相關[5]。SLC26A4基因編碼產生Pendrin蛋白，表達于內耳、甲狀腺和腎臟，SLC26A4基因突變導致Pendrin蛋白的合成和功能的異常，引起前庭水管擴大，使耳蝸前庭的內環境容易受到顱內壓的影響，最終導致內耳毛細胞受損，聽神經萎縮，造成聽覺障礙[6]。

12SrRNA基因是線粒體基因，母系遺傳，與氨基糖苷類藥物敏感性耳聾密切相關,該基因突變可改變線粒體DNA空間結構,形成與氨基糖苷類藥物作用的結合位點,二者結合后阻礙線粒體核糖體蛋白質的合成、抑制ATP合成,K+、Na+、Ca2+離子泵喪失功能,最終因聽毛細胞逐漸死亡而引起不可逆性耳聾[7]。

GJB3基因，常染色體顯性或隱性遺傳性耳聾，與后天高頻感音神經性耳聾有關[8]。GJB3基因突變使縫隙連接蛋白Cx31結構發生改變，最終導致后天高頻感音神經性耳聾[9]。間隙連接蛋白在耳蝸Corti氏器的K+循環通路中至關重要，GJB3基因突變導致其編碼的Cx31蛋白在細胞膜上丟失，導致K+循環被破壞,使Corti氏器局部K+濃度過高，發生鉀中毒,最終導致耳聾[9]。

羊水中的細胞主要來源于胎兒皮膚和黏膜的脫落細胞，在這些細胞中僅有少量活細胞，因此在制備染色體標本時需要對羊水細胞進行1周左右的培養，讓少量活細胞增殖達到一定數量時才能制備染色體核型標本,羊水細胞以貼壁方式增殖[10]。在培養液中僅有少量的活細胞，本研究將這部分細胞放入另一個培養瓶中，少量的活細胞又可以增殖、貼壁。本研究主要是從第二次貼壁羊水細胞中提取DNA。在從培養瓶上刮出貼壁細胞前，都在倒置顯微鏡下觀察到有細胞增殖的克隆。在16個標本中，有15個標本都提取到了一定量的DNA，有一個標本沒有提取到足夠DNA。導致沒有提取到足夠DNA的可能的原因有以下兩個方面：(1)細胞增殖不夠充分，活細胞量少；(2)在DNA提取過程中有操作失誤。在今后的研究中，可以通過評估細胞增殖的克隆數來選取提取羊水細胞DNA的時機，提高提取DNA的成功率。

本研究主要是通過商業化的遺傳性耳聾基因檢測試劑盒對常見的四種耳聾基因進行檢測，這四種耳聾基因遺傳方式明確，耳聾基因致病機制復雜，到目前為止對于遺傳性耳聾沒有根治的方法。如果在行胎兒染色體檢查時，同時對耳聾基因進行檢測，對減少聾兒出生的發生風險有重要意義。

志謝：內蒙古醫科大學附屬醫院婦產科遺傳室武艾寧、于榮鑫和萬驍文老師