pNF-H、MMP-9聯合aEEG對早產兒腦損傷的早期預測價值

趙瑩 徐艷 吳銘 袁文杰 王軍

隨著產科和新生兒重癥監護技術的發展，早產兒的存活率明顯提高，但早產兒腦損傷(brain injury in premature infants，BIPI)的發生率也隨之增加[1]。早產兒腦損傷目前尚無有效的特異治療，目前重點在積極預防，如不能早期發現及干預，常可引起腦性癱瘓、智力低下，甚至死亡。有研究表明,神經絲蛋白H磷酸化亞型(phosphorylated neurofilament heavy subunit，pNF-H)水平變化與神經軸突損傷有關,可反映神經損傷和再生程度[2]。基質金屬蛋白酶-9(matrix metallo proteinase-9，MMP-9)是一類肽鍵內切酶，能降解大部分的細胞外基質，破壞血腦屏障，增加腦水腫、細胞凋亡等病理反應[3]。近年來，振幅整合腦電圖(amplitude integrated EEG，aEEG)在新生兒重癥監護室(NICU)得到越來越廣泛地應用，aEEG可以通過檢測大腦皮層的電活動來評估腦功能，這對新生兒窒息的治療和腦損傷的預后有重要價值[4]。本研究旨在通過檢測早產兒血漿中pNF-H及MMP-9水平，并聯合aEEG檢測技術，探討其對早產兒腦損傷的早期預測價值。

對象與方法

一、對象

1.納入及排除標準：選擇2018年9月至2019年12月收入徐州醫科大學附屬醫院新生兒重癥監護室的具有高風險腦損傷的早產兒為研究對象，進行前瞻性的隊列研究。研究開始時入選74例早產兒，排除其中死亡4例、放棄治療 5 例、失訪 9 例，剩余56例。入選標準：(1)出生胎齡為<37周，男女不限；(2)存在腦損傷高風險因素，包括以下其中之一：①新生兒生后存在中樞性呼吸暫停或抑制狀態、心動過緩、血壓波動、意識改變、驚厥、顱內壓增高、肌張力異常、原始反射異常等臨床表現；②新生兒具有腦缺氧缺血與血流動力學紊亂情況，包括嚴重宮內窘迫與出生時窒息、高或低碳酸血癥等；③新生兒有感染與炎癥反應，包括絨毛膜羊膜炎、宮內感染、壞死性小腸結腸炎等；④ 新生兒具有血液系統疾病表現，包括出凝血異常、中-重度貧血、紅細胞增多癥等；⑤孕母具有產科高危因素，包括血栓或羊水栓塞、孕母合并癥/并發癥、不良嗜好和異常分娩史等[5]。排除標準：由遺傳代謝紊亂、重度高膽紅素血癥、TORCH、中樞神經系統感染等引起的腦損害，以及有明顯染色體疾病和先天畸形患兒。本研究征得患兒家長知情同意，并經本院醫學倫理委員會審核通過。

2.早產兒腦損傷的診斷標準：診斷標準參考2012版《中國當代兒科雜志》的《早產兒腦損傷診斷與防治專家共識》[5]，主要依據早產兒頭顱影像學檢查進行診斷。所有早產兒均在出生3 d 內行首次頭顱超聲檢查，后隔周復查1次，直至出院。對頭顱超聲未見異常，但疑有顱內病變者行頭顱MRI或CT檢查，確診是否存在腦損傷。若頭顱影像學檢查早期發現嚴重腦水腫、各種類型的顱內出血、腦梗死、腦白質損傷等改變，晚期發現多囊腦軟化、腦空洞、腦穿通畸形、嚴重腦室擴張或腦積水及腦萎縮等改變時，視為頭顱影像學異常[5]。有上述影像學改變情況之一者，納入腦損傷組。

根據早產兒的頭顱影像學檢查結果，將56例早產兒分為腦損傷組26例和無腦損傷組30例。其中，頭顱超聲未見異常，但疑有顱內病變而進行頭顱MRI或CT檢查的早產兒有10例。懷疑顱內病變的原因：(1)有4例患兒生后6 h行aEEG檢測，出現缺乏睡眠周期、窄帶下界電壓過低、窄帶帶寬加大、連續性低電壓、癲癎樣波形和爆發抑制等aEEG異常的表現；(2)有6例患兒出現一些嚴重的并發癥，如嚴重的呼吸暫停或抑制、呼吸衰竭、高碳酸血癥、中-重度貧血、多器官功能損害等。這些患兒多存在嚴重的呼吸暫停或抑制，驚厥，發應低下、肌張力低下、原始反射減弱或消失等臨床表現。

二、方法

1.一般情況：記錄早產兒出生時的一般情況，包括性別、胎齡、出生體重、1 min和5 min Apar評分、分娩方式等。

2.血漿pNF-H、MMP-9水平檢測：抽取早產兒生后1 d、3 d、7 d的患兒動脈血1.5 mL，使用肝素抗凝管保存，2 h內離心(4℃，3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min)后吸取上層血漿，置于-80 ℃冰箱內保存待測。試劑采用上海雅吉生物科技有限公司診斷試劑，并采用酶聯免疫吸附法(ELISA法)進行檢測。操作時嚴格按照試劑盒說明書進行，同時記錄各組早產兒不同時間節點血漿pNF-H、MMP-9指標變化情況。

3.振幅整合腦電圖檢查(aEEG)：早產兒生后6 h進行aEEG檢查。檢查采用NicoletOne視頻腦電監測儀記錄腦電圖，監測前常規清潔頭皮，涂抹導電糊，記錄電極為雙額、頂骨電極(相當于10/20系統的F3，F4，C3，C4，P3及P4處)，參考電極位于前額中線距頭頂中心25 mm處，記錄時間為4～6 h。采用 Burdjalov 等創建的 CFM(cerebral function monitor)評分系統[6]對aEEG圖形結果進行評分，并由專業醫師通過aEEG圖形背景活動、睡眠-覺醒周期及是否存在驚厥定性評價早產兒腦發育情況。

4.統計學處理：應用SPSS 24.0統計軟件進行數據處理，對于符合正態分布的計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；對于不符合正態分布的計量資料以中位數(四分位間距)表示，組間比較采用秩和檢驗；計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用卡方檢驗。采用多元Logistic回歸分析構建回歸方程，得到新變量(聯合預測概率)，以新變量為檢驗變量，診斷結果為因變量，作ROC曲線分析，計算靈敏度、特異度及曲線下面積(AUC)。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

在 56例早產兒腦損傷中，44例早產兒(腦損傷組24例，無腦損傷組20例)有臨床表現，占78.6%，其中40例早產兒存在呼吸暫停或抑制狀態，5例出現心動過緩，9例出現血壓波動，12例出現驚厥，7例出現顱內壓增高，38例出現反應低下、肌張力低下、原始反射減弱或消失。

一、一般情況

兩組早產兒的一般情況，包括性別、胎齡、出生體重、1 min和5 min Apar評分、分娩方式，差異均無統計學意義。見表1。

表1 兩組早產兒一般情況比較

二、血漿pNF-H、MMP-9水平變化

腦損傷組早產兒生后1 d、3 d、7 d血漿 pNF-H水平較無腦損傷組均有升高，差異均有統計學意義。腦損傷組血漿 pNF-H 水平在生后3 d時檢測濃度最高，后逐漸下降，7 d明顯下降并趨于生后1 d的濃度。腦損傷組早產兒生后3 d與生后1 d血漿 pNF-H水平之間比較，差異有統計學意義。見圖1。

a：Compared with the non-BIPI group on the same day，P<0.05；b：Comparison between the BIPI group at day 3 and day 1 after birth，P<0.05

腦損傷組早產兒生后1 d、3 d、7 d血漿 MMP-9水平較無腦損傷組均有升高，差異均有統計學意義。腦損傷組血漿 MMP-9水平在生后3 d時檢測濃度最高，后逐漸下降，7 d后明顯下降并稍低于生后1 d的濃度。腦損傷組早產兒生后3 d與生后1 d血漿 MMP-9水平比較，差異有統計學意義。見圖2。

a：Compared with the non-BIPI group on the same day，P<0.05；b：Comparison between the BIPI group at day 3 and day 1，P<0.05

三、振幅整合腦電圖檢查(aEEG)

26例腦損傷組中aEEG結果異常為20例(76.9%)，30例無腦損傷組中aEEG結果異常為5例(16.7%)，兩組差異有統計學意義。腦損傷組aEEG圖形的連續性(Cy)、睡眠-覺醒周期(Co)、寬帶(B)、總評分(T)均低于無腦損傷組，差異均有統計學意義，兩組早產兒aEEG圖形的下界振幅(LB)差異無統計學意義。見表2。

表2 腦損傷組與無腦損傷組之間aEEG監測指標比較

四、Logistic回歸模型

對生后第3天血漿中pNF-H、MMP-9水平及aEEG等變量行Logistic單因素分析，變量對診斷早產兒腦損傷均為有意義的變量(P<0.05)。故以早產兒腦損傷狀態(腦損傷組、無腦損傷組)為因變量，pNF-H、MMP-9及aEEG等檢測結果為自變量，采用Forward Condition方法作多元Logistic逐步回歸分析，得到回歸方程式：Logit(P)=-18.406+0.177×pNF-H+0.132×MMP-9+3.264×aEEG。診斷模型各參數詳見表3。

表3 多元Logistic回歸分析早產兒腦損傷發生的風險因素

五、ROC曲線

以生后第3天血漿pNF-H、MMP-9水平、aEEG結果及三者聯合得到的總體預測概率變量為自變量，疾病診斷結果為因變量，繪制ROC曲線，見圖3。結果顯示，生后3 d血漿pNF-H水平預測早產兒腦損傷的靈敏度80.8%，特異度為90.0%；生后3 d血漿MMP-9水平預測早產兒腦損傷的靈敏度76.9%，特異度為96.7%；生后6 h行aEEG檢查預測早產兒腦損傷的靈敏度76.9%，特異度為83.3%；三者聯合診斷的AUC顯著大于單獨檢測pNF-H、MMP-9水平及aEEG，達到97.3%，診斷的靈敏度達到96.2%，特異度達到90.0%。見表4。

表4 pNF-H、MMP-9、aEEG單獨檢測及運用Logstic回歸模型診斷早產兒腦損傷的診斷價值(%)

圖3 pNF-H、MMP-9、aEEG單獨檢測及運用Logistic回歸模型診斷早產兒腦損傷的ROC曲線

討 論

早產兒腦損傷是圍產期的主要并發癥，也是潛在的長期神經發育障礙。有研究表明，早產兒腦損傷與圍產期多種因素有關，包括胎齡過低、圍產期缺氧、感染/炎癥反應、貧血、低血糖以及應用機械通氣等，而存活者中多遺留神經系統后遺癥，包括腦癱、視力、聽力及學習障礙等問題，嚴重影響其生命質量[7]。因此，應該綜合多種方法，早期識別早產兒腦損傷，尋找針對性的臨床干預措施，降低早產兒致殘率，減輕社會負擔[8]。

神經絲蛋白H(NF-H)是神經絲蛋白的一種亞單位，在維持神經細胞正常形態、軸漿運輸等方面發揮著重要作用[9]。NF-H蛋白序列是由以賴氨酸-絲氨酸-脯氨酸(KSP)序列為中心的6～8個連續重復的氨基酸序列組成的。在軸突神經絲中，基本上所有絲氨酸殘基都磷酸化，而NF-H的樹突和核周形式在這些位點上通常不磷酸化，因此，KSP磷酸化形式是軸突特異性的[10]。眾所周知，這種磷酸化形式的NF-H(即pNF-H)比其他神經絲亞單位更能抵抗鈣蛋白酶和其他蛋白酶，這表明pNF-H可能是軸突損傷和變性的一個非常好的生物標記物。Douglas等[2]研究發現，缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)患兒血漿中pNF-H明顯高于對照組，且血漿pNF-H水平的升高預示著預后不良。Zurek等[11]研究發現，兒童創傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)后2 d的血漿pNF-H水平達到高峰，傷后7 d降至接近對照水平，中、重度損傷組pNF-H表達明顯強于對照組。本研究顯示，早產兒腦損傷組早產兒在生后1 d、3 d、7 d血漿pNF-H水平較無腦損傷組顯著升高，且在生后3 d時觀察到pNF-H水平最高，且生后3 d血漿pNF-H水平預測早產兒腦損傷的靈敏度80.8%，特異度為90.0%。因此，pNF-H可能作為腦損傷的潛在生物學標記物。

基質金屬蛋白酶(MMPs)是一類鋅依賴性肽鍵內切酶，能切割細胞外基質，包括基膜的主要成分和內皮細胞之間的緊密連接[12]。特別是基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)，也被稱為明膠酶B或IV型膠原酶，在腦缺血和炎癥時可以被激活，并降解內皮基底膜的IV型膠原，導致血腦屏障的破壞，增加腦水腫、細胞凋亡等病理反應[3]。有研究表明，當早產兒腦損傷發生時，在多種炎癥因子、細胞免疫反應的刺激下，MMP-9 表達可在短期內形成瀑布效應，但隨患兒病情緩解及在各類臨床干預措施對機體的保護作用下，MMP-9 表達也隨之降低[13]。Okamoto等[14]研究發現，腦室周圍-腦室內出血(periventricular-intraventricular hemorrhage，PVH-IVH)后腦室擴張患兒腦脊液中的MMP-9水平明顯高于對照組，并認為MMP-9可以降解廣泛沉積在蛛網膜下腔的細胞外基質蛋白，在阻止和解決腦室擴張中起重要作用。本研究顯示腦損傷組早產兒在生后1 d、3 d、7 d血漿MMP-9水平較無腦損傷組顯著升高，且在生后3 d時檢測濃度最高，且生后3 d血漿MMP-9水平預測早產兒腦損傷的靈敏度76.9%，特異度為96.7%。因此生后不久檢測早產兒血漿中MMP-9水平有利于早產兒腦損傷的早期預測。

近年來，aEEG在新生兒重癥監護室(NICU)中越來越廣泛地應用于新生兒腦功能的連續監測。目前，aEEG臨床應用的主要領域是足月嬰兒出生窒息后腦結局的預測，腦癲癇活動的檢測和抗癲癇藥物治療的監測，而在早產兒方面，可以利用Burdjalov評分描述皮層電活動的生理成熟，間接地提供了對病理模式的測量[15]。有研究顯示，aEEG低電壓、背景活動不連續和缺失成熟的睡眠覺醒周期與早產兒不良預后甚至與死亡有關[16]。此外，早產兒振幅整合腦電圖的異常背景活動較影像學表現更早出現，更利于早期診斷早產兒腦損傷。本研究顯示，腦損傷組與無腦損傷組中aEEG異常的比例差異有統計學意義，腦損傷組aEEG圖形的連續性(Cy)、睡眠-覺醒周期(Co)、寬帶(B)、總評分(T)均低于無腦損傷組，差異有統計學意義，生后6 h行aEEG檢查預測早產兒腦損傷的靈敏度76.9%，特異度為83.3%，說明 aEEG 可在一定程度上對早產兒腦損傷進行早期預測。

本研究還采用了Logistic回歸及ROC來評價pNF-H、MMP-9聯合aEEG對早產兒腦損傷的早期預測價值。本研究3項指標的回歸分析中比值比(odds ratio，OR)均大于1，提示這些指標升高或異常會增加早產兒腦損傷風險；ROC曲線顯示，三者聯合診斷的AUC顯著大于單獨檢測pNF-H、MMP-9水平及aEEG，達到97.3%，說明三者聯合檢測對早產兒腦損傷診斷價值最高；生后3 d血漿pNF-H、MMP-9及aEEG的靈敏度較低，特異度較高，表明其診斷早產兒腦損傷容易漏診，也就是說假陰性比較高；而三者聯合檢測的靈敏度明顯提高，達到96.2%，特異度也達到90.0%，說明三者聯合檢測可以顯著提高診斷早產兒腦損傷的靈敏度，減少漏診，從而盡早對腦損傷的早產兒進行干預和治療。

綜上所述，pNF-H、MMP-9聯合aEEG對早產兒腦損傷具有早期預測價值。早產兒腦損傷病因復雜，臨床上無明顯特異性表現，一旦發生無特效治療，重在預防。因此，需要根據時機合理聯合兩個或兩個以上的診斷方法進行精準和全面的診斷，并盡早對腦損傷的早產兒進行干預及治療。急性期可以對癥處理，包括避免和減少對患兒的不良刺激，優化呼吸管理，維持體溫、血壓、電解質穩定，積極控制感染及驚厥等；恢復期則以康復治療為主，以期真正改善早產兒遠期神經發育不良的預后。由于本研究樣本量較少，隨訪時間較短，將來有必要進一步研究 pNF-H、MMP-9、aEEG和神經發育預后的關系。