鹿茸中多種水溶性成分的綜合提取工藝的研究

阮豪南 ， 羅佳承 ， 王圳伊 ， 王露露 ， 張 晶，

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院 ， 吉林 長春 130118 ； 2.長春科技學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院 ， 吉林 長春 136000)

Correspondingauthor：ZHANG Jing , E-mail : zhing0701@163.com

鹿茸為鹿科動(dòng)物梅花鹿(CervusnipponTemminck)或馬鹿(CervuselaphusLinnaeus)的雄鹿頭上未骨化密生茸毛的幼角[1],鹿茸脂溶性成分主要包括磷脂、脂肪酸、甾體化合物、前列腺素、多胺、神經(jīng)生長因子等，具有抗疲勞和骨保護(hù)的作用[2-4]。鹿茸水溶性成分主要包括蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖等[5]，具有顯著的抗炎[6]、抗腫瘤[7]和促進(jìn)細(xì)胞增殖[8]等作用。Ruan等[9-10]發(fā)現(xiàn)，鹿茸蛋白可以減輕對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞毒性，并且可通過改善氧化應(yīng)激，抑制炎癥和細(xì)胞凋亡來緩解對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠腎毒性。鹿茸膠原蛋白具有促進(jìn)組織愈合[11]及顯著的護(hù)膚作用[12]。

目前，國內(nèi)外對鹿茸中多水溶性成分的聯(lián)合提取工藝研究相對較少，提取部位較單一，提取率及提取物純度不甚理想，造成鹿茸原料的浪費(fèi)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13]，多肽、蛋白質(zhì)在鹿茸中含量最高，也是鹿茸中的最主要有效成分，目前對其常用的提取方法雖已由常見的靜置提取、磁力攪拌提取發(fā)展到超聲波輔助提取[14]、高壓脈沖電場提取[15]等，但得到的蛋白質(zhì)得率與純度都不高。本文根據(jù)蛋白質(zhì)水化膜可被低濃度醇破壞，進(jìn)而使蛋白質(zhì)沉淀析出的原理，對鹿茸中的蛋白進(jìn)行提取并對提取溶劑濃度進(jìn)行優(yōu)化，獲得了高純度鹿茸蛋白。建立鹿茸成分綜合提取工藝，對鹿茸中蛋白、多糖及膠原蛋白3個(gè)水溶性成分進(jìn)行提取，提高鹿茸的利用率。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器 梅花鹿二杠茸、三岔茸和馬鹿二杠茸、三岔茸于2017年購自吉林雙陽鹿場，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院王全凱教授鑒定為梅花鹿(CervusnipponTemminck)二杠、三岔鹿茸和馬鹿(CervuselaphusLinnaeus)二杠、三岔鹿茸，將其粉碎后過80目篩，待用。

考馬斯亮藍(lán)G250(惠世生化試劑有限公司)；L-羥脯氨酸(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；鹽酸、高氯酸、氯胺T(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；對二甲基氨基苯甲醛(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；所有有機(jī)溶劑均為分析純。

Spectra Max Plu 384續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀，美谷分子儀器有限公司；BP211D 電子天平(萬分之一)，德國Switzerland公司；SC-3614低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鹿茸中水溶性成分提取工藝參數(shù)的確定

1.2.1.1 鹿茸蛋白提取工藝參數(shù)確定 精確稱取鹿茸粉末3.000 g，依次用乙醚和95%乙醇脫脂；分別用乙醚和95%乙醇提取后的殘?jiān)鼡]凈乙醇，殘?jiān)玫蜐舛纫掖祭^續(xù)進(jìn)行提取，以蛋白提取率和含量為參數(shù)指標(biāo)，對乙醇濃度(30%、35%、40%、45%、50%)、提取時(shí)間(1 h、2 h、3 h)、料液比(1∶10、1∶20、 1∶30)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.1.2 鹿茸多糖提取工藝參數(shù)確定 精確稱取鹿茸粉末3.000 g，依次用乙醚和95%乙醇脫脂；分別用乙醚、95%乙醇和低濃度乙醇提取后的殘?jiān)鼡]凈乙醇，殘?jiān)谜麴s水繼續(xù)進(jìn)行提取，以多糖提取率和含量為參數(shù)指標(biāo)，對提取方法(冷浸法、超聲提取法、煎煮法)、提取時(shí)間(0.5 h、1 h、2 h)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.2 提取不同種類鹿茸中水溶性成分對工藝驗(yàn)證 分別取花二杠茸、花三岔茸、馬二杠茸和馬三岔茸粉末各50.000 g，依次用乙醚和95%乙醇脫脂；殘?jiān)鼡]凈乙醇后用35%乙醇(料液比為1∶10)回流提取3次，2 h/次，合并提取液，過濾，濾液加入無水乙醇至溶液乙醇濃度為80%，靜置過夜，于4 500 r/min 離心5 min，將沉淀揮至無醇味，冷凍干燥，得鹿茸蛋白(Velvet antler protein，VAPR)10.500、9.189、8.642 g和7.065 g。將殘?jiān)铀逯?料液比為1∶10)3次，2 h/次，合并濾液，濾液加入無水乙醇至溶液乙醇濃度為80%，靜置過夜，于4 500 r/min離心5 min，將沉淀揮至無醇味，參考劉曉茵等[16]用Sevage法除去溶液中的雜蛋白，冷凍干燥得鹿茸多糖(Velvet antler polysaccharide，VAPO)1.880、1.872、1.760 g和1.709 g。將殘?jiān)稍锖蠹尤?.5 mol/L醋酸溶液(料液比為1∶10)和4%胃蛋白酶[12]于37 ℃ 下提取6 h，提取液過濾后用乙醇沉淀，靜置過夜，于4 500 r/min離心5 min得沉淀。冷凍干燥的鹿茸膠原蛋白(Velvet antler collagen，VAC)1.498、1.451、1.395 g和1.169 g。

1.2.3 鹿茸中水溶性成分提取率和得率的計(jì)算 水溶性成分提取率=(提取所得質(zhì)量/樣品總質(zhì)量)×100%;水溶性成分得率=(提取所得質(zhì)量/樣品中該物質(zhì)質(zhì)量)×100%

1.2.4 鹿茸中水溶性成分含量測定 使用凱氏定氮法[17]測定原材料中蛋白含量。蛋白質(zhì)(%)=[(V1-V2)×N×0.014]/[m×(10/100)] ×F×100%。V1：樣品消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，mL；V2：試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；N：硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度；0.014：1N硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL相當(dāng)于氮克數(shù)；m：樣品的質(zhì)量(體積)，g(mL)；F：氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。

使用Brodford法[18]測定VAPR的含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=26.25x+0.478 5，R2=0.999，線性范圍為0～0.01 mg/mL。

使用苯酚-硫酸法[19]測定VAPO的含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=5.743 6x+0.073 6，R2=0.999 6，線性范圍為0～0.6 mg/mL。

使用羥脯氨酸含量測定法[20]測定樣品中膠原蛋白含量及VAC的含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.027 3x+0.056 9，R2=0.999，線性范圍為0～0.6 mg/mL。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。通過單因素方差(One-way ANOVA)分析和多因素比較的圖基檢驗(yàn)(Tukey test)確定2個(gè)組之間的統(tǒng)計(jì)顯著性差異。P<0.05具有顯著意義，P<0.01具有極顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 水溶性成分提取工藝的確定

2.1.1 VAPR提取工藝參數(shù)的確定 采用乙醇溶劑提取法提取VAPR，對乙醇濃度、提取時(shí)間和料液比3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)優(yōu)化，建立了VAPR最佳提取工藝。如圖1所示，不同乙醇濃度提取中，以35%乙醇提取所得的VAPR得率及含量均較其他濃度差異極顯著(P<0.01)，得率可達(dá)40.40%，含量達(dá)88.90%(圖1A)；不同提取時(shí)間中，以提取2 h所得的VAPR得率較其他濃度差異極顯著(P<0.01)，得率可達(dá)40.14%，含量達(dá)89.77%(圖1B)；不同提取料液比中，以1∶10提取所得的VAPR得率較其他濃度極顯著(P<0.01)，得率可達(dá)40.06%，含量達(dá)88.38%(圖1C)。因此以35%乙醇為提取溶劑按1∶10料液比進(jìn)行回流提取2 h是此方法提取VAPR的最佳提取工藝。

圖1 工藝參數(shù)的改變對VAPR的得率和含量的影響(n=8)Fig.1 Effect of process parameter changes on the yield and purity of VAPR與最低得率相比， *： P<0.05，**： P<0.01； 與最低純度相比，#： P<0.05，##： P<0.01；下圖同Compared with the lowest yield,*： P<0.05，**： P<0.01; Compared with the lowest purity,#： P<0.05，##： P<0.01. The same as below

2.1.2 VAPO提取工藝的確定 為了提高VAPO的提取率及含量，本文以乙醇為溶劑提取VAPO，通過對提取方法、提取時(shí)間和料液比3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)優(yōu)化，建立了VAPO最佳提取工藝。如圖2所示，在冷浸提取法(Cold soaking extraction,CSe)、超聲波提取法(Ultrasonic extraction，Ue)和煎煮提取法(Decoction extraction，De)3種不同提取方法中，以煎煮法所得的VAPO得率及含量均較其他濃度極顯著(P<0.01)，得率可達(dá)19.87%，含量達(dá)90.90%(圖2A)；在不同提取時(shí)間中，以提取1 h所得的VAPO得率較其他濃度極顯著(P<0.01)，得率可達(dá)19.05%，含量達(dá)90.81%(圖2B)；在不同提取料液比中，以1∶10所得的VAPO得率較其他濃度差異極顯著(P<0.01)，得率可達(dá)18.97%，含量達(dá)89.52%(圖2C)。故以1∶10為料液比進(jìn)行煎煮1 h，重復(fù)3次是此方法提取VAPO的最佳提取工藝。

圖2 工藝參數(shù)的改變對VAPO的得率和含量的影響(n=8)Fig.2 Effect of process parameter changes on the yield and purity of VAPO

2.2 不同種類鹿茸水溶性成分的提取結(jié)果 根據(jù)優(yōu)化的提取工藝，分別以花鹿茸和馬鹿茸為原料進(jìn)行工藝驗(yàn)證，采用文獻(xiàn)[12]中的工藝對鹿茸殘?jiān)M(jìn)行VAC的提取。最佳提取工藝對不同鹿茸水溶性成分的提取率結(jié)果如表1所示。花二杠茸的水溶性成分提取率最高達(dá)28.843%，其中VAPR的含量最高。花二杠茸的VAPR的得率最高達(dá)40.210%，花二杠茸VAPR的含量最高可達(dá)92.600%。

表1 不同鹿茸水溶性成分提取結(jié)果Table 1 Extraction rate of water-soluble components of different kinds of antler (%)

花二杠茸中蛋白、多糖和膠原蛋白提取率較花三岔茸分別高9.360%、3.750%和6.840%；馬二杠茸中蛋白、多糖和膠原蛋白提取率較馬三岔茸分別高22.320%、6.880%和24.190%；花二杠茸中蛋白、多糖和膠原蛋白提取率較馬鹿二杠分別高16.290%、11.870%和13.090%；花三岔茸中蛋白、多糖和膠原蛋白提取率較馬三岔茸分別高30.070%、15.250%和31.450%。

3 討論

本試驗(yàn)建立了使用35%乙醇、蒸餾水及酶溶劑依次提取脫脂鹿茸粉末的綜合提取工藝，同時(shí)獲得蛋白、多糖和膠原蛋白3種水溶性成分，總提取率達(dá)28.843%。該工藝分4步，將鹿茸用乙醚及高濃度乙醇脫脂后，進(jìn)行蛋白的提取；總蛋白以35%乙醇為提取溶劑，料液比1∶10，提取3次，2 h/次，提取率較采用緩沖溶液[5]高121.260%，含量達(dá)到92.60%；然后，殘?jiān)运疄槿軇弦罕?∶10，煎煮3次，1 h/次，得到含量為91.30%的多糖，提取率較高壓脈沖電場法[15]提取率高46.460%；最后，殘?jiān)僖晕傅鞍酌复姿崛芤簽樘崛∪軇?料液比為1∶10，酶解提取6 h， 得到含量為91.36%的膠原蛋白。提取過程中，3種水溶性成分相互干擾少，分離度高，在保證多糖及膠原蛋白提取率較高且穩(wěn)定的情況下，提高了鹿茸蛋白的提取率及含量，可使鹿茸中的3種水溶性成分得到更加有效地利用。但本試驗(yàn)前處理采用乙醚脫脂僅適合于實(shí)驗(yàn)室少量提取，對于大量提取或?qū)嶋H生產(chǎn)可考慮采用毒性較小的石油醚進(jìn)行脫脂試驗(yàn)。

采用建立的提取工藝對花二杠茸、花三岔茸、馬二杠茸和馬三岔茸進(jìn)行水溶性成分綜合提取，結(jié)果顯示，鹿茸蛋白及多糖的提取率均較文獻(xiàn)值[5，15]高，且鹿茸蛋白、多糖及膠原蛋白提取物的含量分別達(dá)88%、89%、88%以上，說明該工藝提取效果穩(wěn)定，再現(xiàn)性好。有研究表明，在不同年生的鹿茸中，二杠茸中蛋白和多糖的含量最大，再生茸最小[21]；在不同種類鹿茸的水溶性成分含量上看,梅花鹿鹿茸優(yōu)于馬鹿鹿茸[22]。本試驗(yàn)的提取結(jié)果也顯示，同一種類鹿茸二杠水溶性成分含量高于三岔水溶性成分含量，且梅花鹿鹿茸中水溶性成分含量高于馬鹿鹿茸水溶性成分含量。通過分析比較不同鹿源、不同部位中水溶性成分的含量，發(fā)現(xiàn)梅花鹿二杠中水溶活性物質(zhì)含量最高，同時(shí)也證明了聯(lián)合提取工藝的穩(wěn)定性和高效性，為鹿茸中水溶性活性成分的大量綜合性提取奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步建立鹿茸各有效部位活性成分綜合性提取工藝的研究提供了依據(jù)。