多指標綜合評分結合正交試驗法優(yōu)選大鼠對乙酰氨基酚肝損傷模型

李紫元 ， 龍小鈴 ， 陳彩萍 ， 劉逸雷 ， 梁偉燊 ， 劉俊丹 ，邱文才 ， 倫健熾 ， 唐陸平 ， 何永明

(佛山科學技術學院動物醫(yī)學系 ， 廣東 佛山 528000)

對乙酰氨基酚又名撲熱息痛(APAP)、醋氨酚，是臨床上常用的解熱鎮(zhèn)痛藥。治療劑量的APAP有效、安全，但大劑量用藥時會對實驗動物和人造成肝損傷甚至肝衰竭[1-2]。目前，采用對乙酰氨基酚制作的肝損傷模型應用廣泛，但是并沒有一個穩(wěn)定的造模方法，使得造模效果有較大差異[3-4]。本試驗旨在探究給藥劑量、染毒途徑和采血時間等因素對APAP造成大鼠肝損傷模型效果的影響，為制作藥源性急性肝損傷模型優(yōu)化出最佳的條件。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠，體質(zhì)量(170±20) g，雌雄各半，合格證號：SCXK(粵)2013-0002；高壓滅菌全價顆粒飼料；動物和飼料由廣東省實驗動物中心提供。所有動物飼養(yǎng)于佛山科學技術學院動物室，室內(nèi)溫度為20～25 ℃，相對濕度為50%～70%。 每天12 h日光燈照明。墊料為消毒玉米芯。適應性飼喂3 d，挑選體重均勻的100只用于試驗。

1.2 供試品和試劑 對乙酰氨基酚，購自河北冀衡(集團)藥業(yè)有限公司，批號：71610195；丙氨酸氨基轉移酶(谷丙轉氨酶ALT，批號：16111503)、天冬氨酸氨基轉移酶(谷草轉氨酶AST，批號：16063002)，均購自南京建成生物工程研究所；堿性磷酸酶(ALP，批號：H-170301)、總蛋白(TP，批號：Z-1601131)、白蛋白(ALB，批號：Z-160809)、總膽紅素(TBIL，批號：A-171028)、直接膽紅素(DBIL，批號：A-161120)等，均購自北京利德曼生化股份有限公司。

1.3 主要儀器 AU2700全自動生化分析儀，購自美國Backman公司；Leica組織切片機，購自上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司；KD-BM生物組織包埋機、KD-T生物組織攤靠片機，均購自浙江省金華市科邊儀器設備有限公司；G&G-JJ500電子天平，購自常熟雙杰測試儀器廠。

1.4 正交設計 以APAP染毒劑量、染毒途徑、采血時間為3個因素，每個因素選3個水平，按照L9(34)正交表安排試驗，因素和處理見表1和表3。APAP用40 ℃蒸餾水配制，大鼠分別以灌胃(ig)、腹腔注射(ip)、皮下注射(sc)方式染毒，染毒后4、16 h和28 h用乙醚誘導麻醉，后腔靜脈采血，分離血清用于生化檢測(生化項目委托佛山市南海區(qū)第五人民醫(yī)院檢測)。取出肝臟，稱量，計算肝系數(shù)。取相同部位肝臟用4%甲醛固定，進行組織病理學觀察。

表1 APAP致大鼠肝損傷正交因素水平表Table 1 Orthogonal test of liver damage induced by APAP in rats

1.5 肝損傷綜合評價 對乙酰氨基酚一般引起肝實質(zhì)性細胞壞死，使得丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、直接膽紅素(DBIL)和總膽紅素(TBIL)均會有顯著升高，并且使肝臟腫大[5-6]，根據(jù)各項指標在篩選條件中的主次賦予加比權重：ALT和AST為0.4 U/L；DBIL和TBIL為0.2 μmol/L；肝系數(shù)0.02；其他各項指標和為0.1。由此計算肝損傷的綜合評價指標X。X=(ALT/ALTmax + AST/ASTmax)×0.4+(DBIL/DBILmax+TBIL/TBILmax)×0.2+肝系數(shù)/肝系數(shù)max×0.02+其他指標/其他指標max×0.1。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用Excel表格收集整理數(shù)據(jù)，采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行統(tǒng)計學處理。資料先進行一般描述性分析，計算各計量資料的平均數(shù)、標準差。計量資料進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布及方差齊性采用單因素方差分析；非正態(tài)分布或方差不齊采用秩和檢驗。性別統(tǒng)計分析組間差異采用t值分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠APAP致肝損傷的生化檢測 結果見表2。肝系數(shù)(Liver coefficient，LC)第3組最高，各試驗組顯著高于對照組(P<0.05)。ALT第3組最高，各試驗組顯著高于對照組(P<0.05)。AST第3組最高，第1、2、3、4、6、8、9組顯著高于對照組(P<0.05)。堿性磷酸酶各試驗組與對照組間差異不具有顯著性(P>0.05)。DBIL第2、3組最高，第2、3、4、5組顯著高于對照組(P<0.05)。TBIL第4組最高，第1、2、3、4、9組顯著高于對照組(P<0.05)。

表2 APAP致大鼠肝損傷L9(34)正交試驗優(yōu)化結果 (續(xù)表)Table 2 L9 (34) orthogonal test results of liver injury induced by APAP in rats(continued)

表2 APAP致大鼠肝損傷L9(34)正交試驗優(yōu)化結果Table 2 L9 (34) orthogonal test results of liver injury induced by APAP in rats

2.2 大鼠APAP致肝損傷綜合評價 結果見表3。第3號結果最好，正交試驗優(yōu)選出的造模條件為A1B3C3。

表3 正交試驗安排與優(yōu)化結果Table 3 Orthogonal test arrangement optimization results

2.3 大鼠APAP致肝損傷生化項目不同性別比較 結果見表4。ALT、DBIL、TBIL和ALP這4個肝損傷主要的生化指標，公鼠均大于母鼠且差異顯著(P<0.05)。5′-核苷酸酶(5′-NU)、白蛋白(ALB)、膽堿酯酶(CHE)和總蛋白(TP)這4項指標，母鼠大于公鼠且差異顯著(P<0.05)。肝系數(shù)(LC)和天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和腺苷脫氨酶(ADA)3個指標，公、母大鼠差異不顯著(P>0.05)。

表4 APAP致大鼠肝損傷性別比較Table 4 Gender comparison of APAP induced liver injury in rats

2.4 肝臟組織病理學觀察 結果見中插彩版圖1。不同劑量、不同時間和不同的中毒途徑均出現(xiàn)了明顯的肝細胞空泡變性和肝細胞壞死等病變。

綜合以上結果， 800 mg/(kg·bw) APAP經(jīng)腹腔注射雄鼠，28 h后可得大鼠肝損傷最佳模型。

3 討論

對乙酰氨基酚(APAP)是肝損傷的常用造模藥物。其造成肝損傷的機制是APAP通過細胞色素P450代謝成為N-乙酰基-對-苯醌亞胺(N-acetyl-para-benzoquinone imine，NAPQI)，其會導致急性肝小葉中央型壞死，谷胱甘肽(Glutathione，GSH)會與其結合消除毒性。當GSH耗盡時，NAPQI會發(fā)揮其肝毒性作用并與蛋白質(zhì)巰基相結合為APAP蛋白質(zhì)加合物，此加合物會傳播和放大肝毒性[7-8]。文獻報道，大鼠APAP染毒致肝損傷造模劑量在200～1 000 mg/(kg·bw) 不等[9]。在大鼠體內(nèi)藥動學研究表明，口服給藥后在1～2 h內(nèi)會到達血藥濃度最高峰，T1/2 ka和T1/2 kb分別在0.2～0.5 h和3.5～4.5 h[10]。肝損傷模型的主要染毒方式為灌胃(ig)、腹腔注射(ip)和皮下注射(sc)[11]，皮下注射時藥物主要是通過局部的毛細血管和淋巴管吸收而進入體內(nèi)造成肝損傷，腹腔注射則是藥物可以通過大量的毛細血管和淋巴管吸收進入體內(nèi)，而灌胃主要通過胃腸吸收到達體內(nèi)，而小腸黏膜具有豐富的絨毛并且血流量較大，故急性肝損傷造模效果優(yōu)于皮下給藥[12]。

依據(jù)以上的3個條件選出染毒劑量、染毒方式和采血時間進行正交試驗。結果顯示，9組試驗均對大鼠造成不同程度的肝損傷，但以上3個條件對肝損傷的影響均不顯著。從數(shù)據(jù)篩選可以得出以800 mg/(kg·bw)腹腔注射APAP、28 h后能得到最佳的肝損傷模型。在造模劑量上與前人研究較為符合，隨著給藥劑量的增大，造模效果越好；腹腔給藥造模效果優(yōu)于口腔灌胃，而且操作便捷，故選擇腹腔注射；在模型形成的時間上，可知APAP并未隨著其血藥濃度而損傷肝臟，推測由于APAP并不直接損傷肝臟，而是調(diào)控細胞色素P450代謝而損傷肝臟，故存在一定的延時性。

性別對肝損傷模型也有較大影響。已有研究表明，APAP急性肝損傷的性別差異存在于成年小鼠，具體表現(xiàn)為成年雄性小鼠比成年雌性小鼠肝臟損傷更明顯。本試驗發(fā)現(xiàn)，大鼠公鼠在肝損傷主要指標上高于母鼠且差異顯著，對APAP的敏感性高，造模效果優(yōu)于母鼠。其機制可能與成年雄性鼠肝臟抗氧化代謝酶活性比成年雌鼠低，繼而導致肝損傷加重。母鼠在5′-核苷酸酶、白蛋白、膽堿酯酶、總蛋白這4個指標中高于公鼠，雖然對肝損傷判定有一定指導意義，但不是肝損傷的主要生化指標。所以在APAP肝損傷模型性別選擇上盡量用公鼠，也可以因試驗目的選擇合適的性別。

意外的是，試驗組中白蛋白和總蛋白較對照組有顯著的增高，與肝損傷的表現(xiàn)不同[13]，懷疑與血漿濃縮或腎功能損害有關，需要繼續(xù)研究。

此試驗為藥物性肝損傷優(yōu)選出了最佳的造模條件，并為藥物性肝損傷的藥理藥效學研究提供了基礎數(shù)據(jù)。