十味降糖散對糖尿病大鼠肝臟、脂肪AMPKα和腎CTGF因子表達的調節

蔡 彬 , 張東彥 , 欒思琦 , 茍金花 , 馮雪倩 , 馬林鳳 , 陶 瑞 , 唐 靜 ， 羅 軍 , 賀閃閃 , 鄭小波

(西南大學動物科學學院 ， 重慶 榮昌 402460)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素等各種致病因子[1]等引發的，DM中以Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)為主，占比超過90%，Ⅱ型糖尿病患者常常伴隨著糖、蛋白質和脂肪等代謝紊亂，T2DM患者容易發生感染、腎功能衰竭等并發癥[2]，其中糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是Ⅱ型糖尿病嚴重的腎臟相關并發癥。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一種絲氨/蘇氨酸蛋白激酶，也是一種關鍵的能量感受器，通過調節細胞代謝來維持細胞內能量平衡[3]，AMPK是一個由 α、β 和 γ 三個亞單位組成的三聚體，α 亞基具有催化作用，主要分布于肝、腎、肺、心臟和腦，AMPK被激活后可以增強葡萄糖攝取利用，可以產生更多能量，同時能夠減少葡萄糖異生，糖原、甘油三脂的合成代謝，從而調節機體能量平衡[4]； 肝臟參與糖類和脂肪代謝，是糖類儲存和釋放以及脂肪合成的主要器官，肝臟能抑制葡萄糖和脂肪酸合成，促進脂肪酸氧化，脂肪中AMPK能抑制脂肪酸的合成和分解，AMPK被激活能夠減少脂肪和甘油三酯的合成[5]。結締組織生長因子(Connective tissue growth factor,CTGF)是腎小球硬化和腎小管間質纖維化過程中的關鍵性細胞因子，腎小球肥大和腎小管間質纖維化與CTGF的高表達呈正相關[6-7]。鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)誘導的Ⅱ型糖尿病模型，對大鼠肝腎功能有損害作用，從而使得肝臟AMPK和腎臟CTGF的表達受到影響。本試驗研究十味降糖散對肝臟、脂肪AMPKα和腎CTGF表達的影響，進一步探究十味降糖散對肝腎保護和脂代謝的機制，為十味降糖散的臨床應用與開發提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠，雄性，4周齡，體重為(95±5) g，購自成都達碩實驗動物有限公司(四川省實驗動物檢測中心提供，合格證號：0015190)。

1.2 試驗藥品配制 十味降糖散:黃芩、黃連、地骨皮、玄參、沙參、生地、麥冬、花粉、知母、藕汁[8-9]組成，水煎濃縮為含生藥500 g/L。高糖高脂飼料：由蛋黃3%，豬油18%，蔗糖20%，基礎飼料59%[9]混合配制而成。

1.3 主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ)，購自美國Sigma公司；AMPKα抗體，購自美國Cell Signaling Technology公司；細胞裂解液，購自中國碧云天生物技術研究所；分離膠緩沖液和濃縮膠緩沖液，均購自中國上海哈靈生物科技有限公司；PVDF膜，購自美國Millipore公司；BSA試劑盒，購自中國Hzbscience公司；兔抗CTGF多克隆抗體、山羊抗兔IgG和DAB免疫組織化學顯色試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4 主要儀器 穩豪型血糖儀為上海強生醫療器材有限公司產品；CR3i型超低溫冷凍離心機為Thermo Fisher 公司產品；高速離心機為上海盧湘儀離心機儀器有限公司產品；全自動凝膠成像系統和凝膠成像分析系統為上海勤翔科學儀器有限公司產品；UB100i型顯微鏡為鄭州南北儀器設備有限公司產品；SQ2125型石蠟切片機為徠克公司產品；IMS圖像分析系統為基爾頓上海生物科技有限公司產品。

1.5 試驗方法

1.5.1 模型的建立 采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導Ⅱ型糖尿病模型和糖尿病腎病(DN)模型。Ⅱ型糖尿病模型構建方法：按35 mg/(kg·bw)劑量腹腔注射[10]，72 h后測量空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L，Ⅱ型糖尿病模型造模成功；糖尿病腎病(DN)模型：按45 mg/(kg·bw)的劑量腹腔注射[11]，72 h后血糖值≥16.7 mmol/L，為糖尿病造模成功的標準，在糖尿病成模2周后，取大鼠的尿液測尿蛋白，若呈陽性，大鼠的糖尿病腎病(DN)模型造模成功。

1.5.2 試驗分組 將100只SD大鼠用普通飼料飼喂1周，然后隨機挑選12只大鼠作為空白組，飼喂普通飼料，將需要造模的88只大鼠用高糖高脂飼料飼喂4周后，隨機挑選44只誘導Ⅱ型糖尿病，隨機分為模型Ⅰ組(Ⅱ型糖尿病模型)和治療Ⅰ組；另外44只大鼠誘導糖尿病腎病(DN)，隨機分為模型Ⅱ組(DN模型)和治療Ⅱ組。治療Ⅰ組和治療Ⅱ組每天用十味降糖散灌胃1次，灌服的劑量為3 mL/(kg·bw)，模型Ⅰ組和模型Ⅱ組灌服同等比例的生理鹽水；空白組大鼠不做任何處理，模型組和治療組大鼠飼喂高糖高脂飼料直到試驗結束，各組均自由飲水。

1.5.3 肝臟和睪丸脂肪墊AMPKα的測定 在造模成功的第8周，處死大鼠，分別取空白組、模型Ⅰ組和治療Ⅰ組大鼠肝臟和右側睪丸脂肪墊，放入液氮冷凍，-80 ℃保存。稱取80 mg肝臟和脂肪，加入細胞裂解液，冰浴并研磨組織，裂解40 min。4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，保留上清液。嚴格按照試劑盒說明書，測定肝臟和睪丸脂肪墊組織中的AMPKα，經常規蛋白印跡法操作，凝膠成像儀成像后，蛋白條帶用軟件Imagine J進行分析處理。

1.5.4 腎臟CTGF的測定 在造模成功后的第10周，處死大鼠，分別取空白組、模型Ⅱ組和治療Ⅱ組大鼠左腎，用10%的中性甲醛固定24 h后，石蠟包埋后切片，嚴格按照DAB免疫組織化學顯色試劑盒說明書操作，選取切片不同的位點，分別在200倍和400倍鏡下拍片觀察，用IMS圖像分析系統對切片進行半定量分析，測量CTGF蛋白平均光密度、陽性面積和陽性率。

2 結果

2.1 十味降糖散對肝臟、睪丸脂肪墊AMPKα表達的影響 Western Blot結果見圖1，分析結果如圖2所示，與空白組比較，模型Ⅰ組肝臟AMPKα表達極顯著降低(P<0.01)；與模型Ⅰ組比較，治療Ⅰ組AMPKα表達顯著升高(P<0.05)；空白組和治療Ⅰ組肝臟AMPKα表達無差異(P>0.05)；與空白組相比，治療Ⅰ組和模型Ⅰ組睪丸脂肪墊AMPKα表達無差異(P>0.05)。

圖1 肝臟、睪丸脂肪墊AMPKα表達的Western Blot分析Fig.1 Western Blot analysis of AMPKα expressionin liver and testicular fat pads 1～3：空白組、模型Ⅰ組、治療Ⅰ組的肝臟； 4～6:空白組、模型Ⅰ組、治療Ⅰ組的脂肪1-3：Liver of blank group, modelⅠgroup,treatmentⅠgroup; 4-6: Fat of blank group, modelⅠgroup,treatmentⅠgroup

圖2 十味降糖散對肝臟、睪丸脂肪墊AMPKα表達的調節Fig.2 Shiwei Jiangtang powder regulates AMPKα expression in liver and testicular fat pad**：與空白組比較，P<0.01；#： 與模型Ⅰ組比較，P<0.05**： Compare to blank group, P<0.01; #: Compare to model Ⅰ group, P<0.05

2.2 腎臟免疫組織化學染色觀察 由封三彩版圖3可知，空白組中腎小球內幾乎沒有CTGF蛋白，細胞核明顯，腎小管內有少量的CTGF蛋白(封三彩版圖3A、3B)；模型Ⅱ組腎小球有腫大的現象，腎小管中有大量的CTGF蛋白，主要集中在近曲小管和遠曲小管(封三彩版圖3C、3D)；治療Ⅱ組腎小球內CTGF蛋白較少，腎小管中有少量的CTGF蛋白，分布在近曲小管和遠曲小管中，細胞核染色明顯(封三彩版圖3E、3F)。

2.3 腎臟CTGF蛋白的平均光密度、陽性面積和陽性率 由圖4～6可知，與空白組比較，模型Ⅱ組CTGF平均光密度、陽性面積和陽性率顯著升高(P<0.05)；與模型Ⅱ組比較，治療Ⅱ組CTGF平均光密度、陽性面積和陽性率顯著降低(P<0.05)；與空白組比較，治療Ⅱ組CTGF平均光密度、蛋白陽性面積和陽性率密度差異不顯著(P>0.05)。

圖4 CTGF蛋白表達的平均光密度比較Fig.4 Comparison of average optical density of CTGF protein expression*：與模型Ⅱ組比較， P<0.05；下圖同*：Compare to modelⅡgroup, P<0.05. The same as below

3 討論

AMPKα調節糖、脂肪、蛋白質等物質的代謝，在肝臟、脂肪、肌肉組織中均有表達，肝臟是葡萄糖代謝的主要場所，增加葡萄糖的攝取和利用，促使能量代謝趨于平衡。肝臟AMPK主要通過抑制糖異生和葡萄糖產生來控制葡萄糖，黃芩有降低血糖、血脂，黃連有降血糖、抗心律失常等作用，黃芩、黃連屬于清熱燥濕配伍，常需合用起協同增效作用[12]，地骨皮具改善胰島功能，增加胰島素的分泌，從而降低血糖[13]；十味降糖散能夠促進糖尿病大鼠肝糖原的合成，降低糖化血紅蛋白，降低脂聯素含量[8]，脂聯素能夠激活AMPK，抑制葡萄糖-6-磷酸酶(G6 Pase)的活性，從而減少肝糖產生[14]，調節糖尿病造成的糖代謝紊亂。本試驗表明,十味降糖散可以上調糖尿病大鼠肝臟AMPKα的表達，調節機體糖代謝，從而對肝臟起保護作用。

圖5 CTGF蛋白表達陽性面積的比較Fig.5 Comparison of positive area of CTGF protein expression

圖6 CTGF蛋白表達陽性率比較Fig.6 Comparison of positive rate of CTGF protein expression

脂肪細胞AMPK能夠抑制脂肪酸的合成和分解，促進脂肪酸氧化[15]，通過感受胞質內AMP/ATP比值的改變，當AMP/ATP增高時，AMPK磷酸化為p-AMPK而激活[16]，激活的AMPK可以使乙酰輔酶A 羧化酶(ACC)磷酸化而失活，ACC通過催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A，在脂肪酸的代謝過程中發揮重要的作用，而抑制ACC活性可以抑制脂質合成[17-18]。地骨皮總黃酮通過降低血膽固醇和三酰甘油，調節血脂水平[19]；天花粉凝集素調節血脂水平有顯著作用，能夠促進脂代謝的良性循環；十味降糖散可以增強血清超氧化物歧化酶(SOD)的活性，升高血清高密度脂蛋白(HDL)含量，降低血清丙二醛(MDA)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、脂聯素含量，減少內臟脂肪含量，改善機體的脂肪代謝紊亂[20]。本試驗表明，十味降糖散對睪丸脂肪墊AMPKα的表達無影響，調節脂肪代謝可能是通過其他途徑完成的。

Ⅱ型糖尿病患者常伴發腎功能衰竭，對腎臟的損害主要是以糖尿病腎病(DN)為主，DN病程發展到微量白蛋白尿時，CTGF在腎小球區域表達增高，系膜細胞增生，可導致腎小管萎縮、硬化，促進腎間質纖維化[21]。黃芩能夠緩解DN病程發展引起的腎臟病理損傷，降低尿蛋白排泄[22]，黃連、生地及其配伍對Ⅱ型糖尿病大鼠有治療作用，但黃連、生地配伍治療效果優于單味藥[23]；十味降糖散可以抑制DN大鼠腎臟肥大，緩解大鼠體重的下降、腎功能的降低、腎小球和腎小管病變，減少尿微量白蛋白(mALB)、血清肌酐(CREA)，尿素(UREA)的增加，降低TG，提高HDL[24]。本試驗結果表明，十味降糖散能夠抑制DN腎組織CTGF的表達，減緩腎小管萎縮、硬化，抑制腎間質纖維化，對腎臟起到保護作用。

十味降糖散能夠上調糖尿病大鼠肝臟AMPKα的表達，抑制腎臟CTGF的表達，調節機體糖脂代謝，對肝腎起到保護作用；十味降糖散對睪丸脂肪墊AMPKα的表達無影響，調節脂代謝可能通過其他途徑。