Neddylation在病毒感染性疾病中的作用

白 玉 ， 趙立紅 ， 連鵬敬 ， 李靜云 ， 喬 健

(中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 北京 海淀 100193)

Neddylation是一種與泛素化修飾相似的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，通過影響蛋白質(zhì)的構象、降解和定位等，從而調(diào)控細胞周期、細胞凋亡與增殖以及免疫反應等一系列生命活動。運用抑制劑MLN4924特異性抑制Neddylation可阻止腫瘤細胞增殖。近些年研究發(fā)現(xiàn)，Neddylation還能通過調(diào)控病毒復制或宿主免疫反應而影響病毒感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展，所以調(diào)節(jié)Neddylation在未來有望成為一種治療病毒感染性疾病的手段。本文介紹Neddylation在病毒感染性疾病中的作用及其機制，為進一步探討Neddylation在病毒感染性疾病治療方面的研究及其應用提供重要的參考。

1 Neddylation概念及其特征

Neddylation是新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，該修飾方式與蛋白質(zhì)泛素化修飾過程極為相似。NEDD8是類泛素化蛋白家族成員，通過一系列與泛素化相似的酶促反應，與底物蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基共價結合的過程稱為Neddylation。Neddylation能使底物蛋白質(zhì)的構象和定位等發(fā)生改變，進而影響一系列生命活動過程，如調(diào)控細胞周期、細胞增殖和凋亡以及免疫反應等。類泛素分子NEDD8已于1992年在胚胎小鼠大腦中克隆出來，NEDD8由81個氨基酸組成，與泛素分子的氨基酸序列同源性為80%，在動物、植物和真菌中高度保守，且在大部分真核生物組織中都表達，暗示其在生命活動中扮演重要角色[1]。

2 Neddylation反應過程

蛋白質(zhì)的Neddylation修飾與泛素化修飾相似，也為一系列激酶參與的級聯(lián)反應，參與Neddylation修飾的蛋白酶主要包括：E1 NEDD8激活酶、E2 NEDD8結合酶和E3 NEDD8連接酶3種。當NEDD8分子前體合成后，被Neddylation酶(NEDP1和UCH-L3)在第76位甘氨酸水解暴露出雙甘氨酸序列，后者作為與底物蛋白結合位點被E1 NEDD8激活酶(NAE1和UBA3組成的異二聚體)在鎂離子和ATP參與下發(fā)生腺苷化，再通過硫脂鍵轉(zhuǎn)移到NAE的半胱氨酸側鏈上 ； 然后有活性的NEDD8通過硫脂反應被轉(zhuǎn)移到E2 NEDD8結合酶(UBC12和UBE2F等) ； 再經(jīng)E3 NEDD8連接酶將NEDD8 轉(zhuǎn)移到底物蛋白N端的賴氨酸形成異肽鍵，最終底物蛋白完成Neddylation修飾[1-2]。Cullin家族蛋白是目前研究最為清楚的Neddylation底物，包括Cullin-1、2、3、4a/4b、5和7等，Cullin家族蛋白需要裝配成蛋白質(zhì)復合體才能行使功能。Neddylation是蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程之一，該過程是可逆的，被Neddylation修飾的底物蛋白質(zhì)，在去Neddylation酶催化下發(fā)生Deneddylation，將NEDD8 從被修飾后的底物蛋白上解離下來，Deneddylation酶包括CSN、NEDP1、USP21和UCH-L3等。生理情況下，Neddylation和Deneddylation處于動態(tài)平衡狀態(tài)，在蛋白質(zhì)修飾過程中起重要作用(圖1)。目前研究發(fā)現(xiàn)，E1 NEDD8激活酶包括NAE1和UBA3，所以阻止NEDD8 與E1 NEDD8激活酶結合就可特異性抑制Neddylation的發(fā)生[1,3]。有資料顯示，MLN4924能競爭性抑制NAE與NEDD8的結合，從而阻止Neddylation發(fā)生，其具體機制為在鎂離子存在條件下，ATP脫去2個磷酸基團并釋放能量生成AMP，AMP與NEDD8結合成NEDD8-AMP復合物； 后者又與NAEβ亞基的半胱氨酸殘基中活性巰基位點反應，形成NAE-NEDD8硫酯復合物并釋放AMP，最終形成E1-S-CO-NEDD8三元復合物。MLN4924與AMP在結構上極為相似，MLN4924與NEDD8分子的親和力遠高于AMP，故MLN4924極易與NEDD8發(fā)生親和加成反應形成MLN4924-NEDD8復合物，從而競爭性抑制了NAE與NEDD8的結合，導致Neddylation被阻止[3]。

圖1 Neddylation 修飾蛋白質(zhì)過程示意圖

3 Neddylation對病毒復制的直接調(diào)控作用及機制

以往研究發(fā)現(xiàn)，Neddylation參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，將MLN4924與細胞自噬阻斷劑進行聯(lián)合應用，能明顯抑制肺臟和肝臟腫瘤細胞的增殖[1]。目前，MLN4924作為抗腫瘤藥物已經(jīng)進入一期臨床試驗。隨著對Neddylation研究的不斷深入，科學家發(fā)現(xiàn)，Neddylation在病毒感染性疾病發(fā)生和發(fā)展中同樣扮演著十分重要的角色。

每年冬、春季是流感病毒感染人和其他動物的高發(fā)期，嚴重威脅全球公共衛(wèi)生安全、畜禽行業(yè)健康和經(jīng)濟發(fā)展。A型流感病毒的遺傳基因由8個RNA片段組成，其中病毒的聚合酶堿性蛋白2(Polymerase basic 2，pb2)基因編碼的PB2蛋白是RNA聚合酶的組成部分，PB2蛋白在A型流感病毒復制中結合帽子結構，并且其羧基端含有核定位序列，是A型流感病毒復制中不可缺少的蛋白質(zhì)之一。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，E3 DEDD8連接酶—HDM2能促進PB2蛋白的K699R位點發(fā)生Neddylation，結果導致PB2蛋白的穩(wěn)定性下降；過表達HDM2也能減弱PB2蛋白的穩(wěn)定性并抑制A型流感病毒的復制[4]。

Neddylation不僅對RNA病毒的蛋白能進行翻譯后修飾直接影響病毒復制，還可對DNA病毒的蛋白進行翻譯后修飾而影響病毒的復制。我國是人感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)的高發(fā)國家，長期感染HBV，在后期可導致感染者繼發(fā)肝癌的可能性，HBV感染的高發(fā)生率和感染后的嚴重病癥危害我國公共衛(wèi)生安全。HBV的HBx蛋白在HBV誘導的肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，Liu等研究發(fā)現(xiàn)，E3 NEDD8連接酶—HDM2能促進HBx蛋白在K91和K95位點發(fā)生Neddylation，結果導致HBx蛋白穩(wěn)定性異常和誘導肝癌作用增強[5]。上述資料表明，Neddylation可直接對RNA病毒和DNA病毒的蛋白質(zhì)進行翻譯后修飾以影響蛋白穩(wěn)定性，從而直接影響病毒復制及其致病性。

4 Neddylation對病毒復制的間接調(diào)控作用及機制

在病毒感染過程中，病毒與宿主間相互作用影響病毒復制，而在此相互作用中，機體免疫系統(tǒng)扮演重要角色。Neddylation是蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一，而蛋白質(zhì)參與機體免疫反應的各個環(huán)節(jié)，所以Neddylation可通過調(diào)控機體免疫反應而間接影響病毒復制。

當病毒侵入機體后，細胞會通過模式識別受體(Pattern recognition receptor，PRR)識別病原而激活下游的干擾素調(diào)節(jié)因子(Interferon regulatory factor，IRF)或核因子(Nuclear factor，NF)-κB等信號通路而增加干擾素(Interferon，IFN)或相關細胞因子表達而消滅病毒[6]。MLN4924能抑制Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)-3、4和維甲酸誘導基因蛋白Ⅰ(Retinoic acid-inducible gene Ⅰ，RIG-Ⅰ)樣受體(Retinoic acid-inducible gene Ⅰ-like receptor，RLR)介導的IFN-β表達，該抑制效果在NEDD8敲除的細胞中消失[7-8]。Sun等研究發(fā)現(xiàn)，對PR8和H9N2亞型流感病毒感染的小鼠，再注射MLN4924后，小鼠肺臟中相應病毒滴度明顯降低，且前促炎細胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α等分泌量明顯低于未注射MLN4924的病毒感染小鼠；病理組織學檢測顯示，注射MLN4924能減輕流感病毒感染小鼠所致急性肺損傷(Acute lung injury)的發(fā)病程度，進一步研究發(fā)現(xiàn)，MLN4924通過抑制NF-κB與NEDD8結合而降低Neddylation，進而減少NF-κB與其抑制因子-α(NF-κB inhibitor α，IKB-α)的解離，使NF-κB磷酸化減弱，最終導致細胞因子基因轉(zhuǎn)錄水平降低[9]。在Zhang等[4](在前文“3. Neddylation對病毒復制的直接調(diào)控作用及機制”中介紹)和Sun等[9]的2項研究中，Neddylation對流感病毒復制影響略有不同的原因可能是：Zhang等的研究是在體外進行，而Sun等的研究是在體內(nèi)進行，Neddylation是一個極其復雜的調(diào)控過程，體內(nèi)外可能會有不同；另外，在2項研究中所用的流感病毒毒株不同，可能也是造成Neddylation在流感病毒復制中產(chǎn)生不同作用的原因，但具體原因有待于進一步深入探究。人感染Ⅰ型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus-1，HSV-1)后，其常表現(xiàn)為呼吸道、生殖道和皮膚黏膜等處出現(xiàn)大量破潰，孕婦感染HSV-1后，病毒可通過胎盤屏障感染胎兒，導致胎兒發(fā)育遲緩、智力低下、小頭、小眼、心臟異常以及四肢發(fā)育畸形等，HSV-1在體內(nèi)存活時間較長，機體不易清除該病毒，嚴重危害人類健康。有研究發(fā)現(xiàn)，給處于HSV-1感染早期的小鼠注射MLN4924后，小鼠體內(nèi)IFN-β生成量明顯減少，而在病毒感染后的晚期階段，MLN4924能明顯增加NF-κB的磷酸化，誘導IFN-β大量生成，從而抑制病毒復制[10]。在水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)感染小鼠中，抑制Neddylation能降低感染早期階段IFN-β表達，其機制可能是抑制Neddylation能減弱IKB-α與NF-κB的解離，影響NF-κB進入細胞核；在病毒感染后期IFN-β表達增加，其產(chǎn)生機制可能是VSV誘導IRF3活性增強，其作用效果強于對NF-κB信號通路的抑制作用，從而導致IFN-β表達增加[11]。以上2項研究均表明，MLN4924處理HSV-1或VSV感染不同時期的小鼠對IFN表達產(chǎn)生不同的作用效果。前促炎細胞因子IL-1β能誘導大量細胞因子的產(chǎn)生和誘導免疫細胞成熟，IL-1β的成熟需要Caspase-1切割修飾，而Caspase-1本身需要Neddylation后才具有切割蛋白活性。Caspase-1具有CARD、P10和P20三個結構域，其中P10和P20均需要進行Neddylation。運用MLN4924處理呼吸道合胞體病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)感染的非洲綠猴腎細胞系后，細胞內(nèi)Caspase-1生成減少，進而使成熟IL-1β生成不足而降低機體免疫能力，最終導致機體對病原微生物的抵抗力降低以及病毒大量復制[12]。以上資料表明，Neddylation對參與天然免疫反應的某些關鍵蛋白質(zhì)進行翻譯后修飾以影響IFN及其下游的抗病毒蛋白表達，間接影響病毒復制，最終影響病毒感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展等。

免疫細胞可直接參與或調(diào)節(jié)機體免疫反應，巨噬細胞(Macrophages)、樹突狀細胞(Dendritic cells，DC)和T細胞等在抗病毒反應中發(fā)揮重要作用。有研究報道，Neddylation通過修飾細胞周期相關蛋白而調(diào)節(jié)細胞周期進程，影響巨噬細胞的增殖和凋亡，運用MLN4924處理巨噬細胞后發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞的細胞周期被阻滯，從而影響細胞增殖[13]。運用MLN4924處理DC后發(fā)現(xiàn)，不但DC的成熟及其分泌細胞因子功能均被抑制，而且激活T細胞的能力也受到限制[14]。Jin等研究發(fā)現(xiàn)，T細胞適配(Adaptor)蛋白Shc的Neddylation對通過細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases，Erk)信號通路激活自身行使免疫功能是必不可少的，且NEDD8缺失直接影響CD4+T細胞的免疫功能[15]。以上資料表明，Neddylation通過蛋白質(zhì)翻譯后修飾作用影響免疫細胞的細胞周期、細胞成熟與分化以及分泌細胞因子等調(diào)節(jié)機體免疫功能，間接影響病毒復制，最終影響病毒感染性疾病的發(fā)生和發(fā)展等。

5 展望

Neddylation是與泛素化修飾相似的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式。MLN4924是Neddylation的特異性抑制劑，其具有明顯抑制腫瘤細胞生長的作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，Neddylation通過直接和間接方式調(diào)節(jié)病毒的復制及其致病性，但在不同種類病毒中，Neddylation對于調(diào)控病毒復制的效果不同，產(chǎn)生該現(xiàn)象的具體原因有待于進一步深入研究。綜上所述，對Neddylation詳細作用及其機制，尤其是其在病毒感染中的具體功能的進一步研究，使其有望成為未來治療病毒感染性疾病的重要手段之一。