石榴花水提物的體內(nèi)外抗炎作用

艾米娜什·哈力別克 ， 特列克·阿依恒別克 ， 王曉杰 ， 艾克拜爾·依明 , 阿得力江·吾斯曼 ， 賽福丁·阿不拉

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 新疆 烏魯木齊 830052)

炎癥反應(yīng)是一種重要的機(jī)體防御過程，其中巨噬細(xì)胞的激活是炎癥反應(yīng)的啟動環(huán)節(jié)[1]。巨噬細(xì)胞能夠啟動體內(nèi)的炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，并調(diào)控炎癥反應(yīng)，釋放炎性細(xì)胞因子等。脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要成分，能激活炎癥細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)，在炎癥反應(yīng)過程中，LPS通過其Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)激活巨噬細(xì)胞，從而導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素6(Interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)等的產(chǎn)生[2]，通過LPS刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子以建立體外炎癥模型，可以模擬體內(nèi)炎癥反應(yīng)過程，常用于抗炎藥物作用機(jī)制的研究[3]。石榴花為石榴科(Punicaceae)石榴屬(PunicL.)植物石榴(PunicgranatunL.)的干燥花瓣[4]。石榴在5～7月開花，花期長，不能結(jié)果的鐘狀花和部分筒狀花會自然脫落，因此石榴花資源豐富，極具開發(fā)價值。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，石榴花富含多酚、黃酮等多種活性物質(zhì)[5]，具有良好的降血糖、降血脂、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等功效。石榴花可用于治療惡心嘔吐、腹瀉、蠕蟲感染等胃腸道疾病，支氣管炎等呼吸系統(tǒng)疾病，冠心病、中風(fēng)等心腦血管疾病[6]。Sarker等[7]采用角叉菜膠所致鼠足腫脹動物模型觀察石榴花的抗炎作用，結(jié)果表明，石榴花石油醚-醋酸乙酯、二氯甲烷如甲醇提取物，對角叉菜膠所致大鼠足腫脹炎癥模型的抑制率分別為26.92%、27.97%和21.85%。Xu等[8]研究表明，石榴花乙醇提取物通過調(diào)節(jié)炎癥中多種介質(zhì)和細(xì)胞因子的合成而產(chǎn)生潛在的抗炎作用，但對石榴花水提物(Pomegranate flower extract water，PEW)的抗炎功效方面報道少有。因此，本試驗通過四甲基偶氮唑鹽[D3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]法測定PEW對巨噬細(xì)胞的安全濃度 ； 用PEW處理LPS誘導(dǎo)的炎癥模型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞后，測定巨噬細(xì)胞上清液中的一氧化氮(Nitric oxide，NO)、TNF-α和IL-6促炎介質(zhì)的釋放量，并通過耳郭腫脹試驗，檢測PEW對二甲苯所致的小鼠耳郭腫脹的抑制作用，綜合體內(nèi)外試驗探明PEW的抗炎效果，為石榴花的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明小鼠50只，雌性，體重(20±2)g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2019-0001。

1.2 藥物及試劑 石榴花，購自新疆維吾爾自治區(qū)民族醫(yī)院；營養(yǎng)肉湯，購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清，購自江蘇恩莫阿賽生物技術(shù)有限公司；雙抗，購自美國Genview 公司；DMEM培養(yǎng)基、PBS，均購自HyClone公司；MTT、二甲基亞砜、二甲苯、NO試劑盒，均購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒，均購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 試驗儀器 TDL-40B離心機(jī)、TDL-40B型號離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；SHE-3000酶標(biāo)分析儀，北京賽爾福知心科技有限公司產(chǎn)品；PL2002電子天秤，上海托利多儀器公司產(chǎn)品；顯微鏡，Nikon公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀，上海亞榮科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱，德國Eppendorf 生物科學(xué)公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 石榴花水提物的制備 稱取已干燥粉碎過的石榴花300 g過24目篩，經(jīng)蒸餾水浸泡2 h，在溫度為95 ℃、料液比1∶10的條件下提取2 h，重復(fù)2次，合并提取液并濃縮至1 g/mL，對濃縮液高壓滅菌，冷卻后置于4 ℃冰箱備用。

1.4.2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離 制備試驗前3 天，給小鼠腹腔注射6%淀粉肉湯(1 mL/只)。小鼠頸椎脫臼處死后,放入盛有75%酒精的燒杯中浸泡3 min。取出小鼠，置于無菌紗布上，腹面朝上，用鑷子提起小鼠下腹部皮膚，剪開一小口，撕開皮膚，完全暴露腹膜。吸入10 mL PBS緩沖液，用鑷子提起腹膜，向腹腔中注入PBS緩沖液，然后吸出腹腔液。將吸出的腹腔液注入15 mL離心管中，以2 000 r/min離心5 min，棄上清后，收集沉淀，即得腹腔巨噬細(xì)胞。用完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)。用完全培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1.0×106個/mL，將細(xì)胞懸液加到96孔細(xì)胞板中，100 μL/孔，置CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)4～6 h使巨噬細(xì)胞貼壁[9]。

1.4.3 MTT法檢測石榴花水提物對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞安全濃度 細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁之后，棄掉細(xì)胞上清液，試驗組加入100 μL不同濃度的PEW。同時設(shè)置空白對照組，只加配制好的完全培養(yǎng)基100 μL， 每組設(shè)置4個復(fù)孔。再次將96孔板放置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后，小心地吸去每孔中的細(xì)胞上清液，加入20 μL配置好的MTT溶液，再次放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。作用4 h后，將每個孔中的培養(yǎng)液棄去，并在每孔中加入150 μL DMSO溶液，震蕩5 min，觀察到藍(lán)紫色的結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀測定570 nm下的吸光度(Optical density，OD值)[10]。計算公式：細(xì)胞存活率/%=試驗組不同樣品OD均值/空白對照組OD均值×100%。

1.4.4 Griess法檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放的NO含量 取密度為1.6×106個/mL的巨噬細(xì)胞懸液1 mL， 加入到6孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h之后棄掉細(xì)胞上清液，每孔中加入500 μL完全培養(yǎng)基后，試驗組加入100、50 μg/mL和10 μg/mL的PEW 500 μL，空白對照組加入500 μL的DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)4 h后，吸掉上清液，除了空白對照組以外均加1 mL LPS，空白對照組加入1 mL 完全培養(yǎng)基。將6孔板放入到CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后按照NO檢測試劑盒說明書檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的NO含量[10-11]。

1.4.5 ELISA法檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-6含量 與上述NO含量測定同樣的方法準(zhǔn)備細(xì)胞上清液，參照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行TNF-α和IL-6含量的測定[12]。

1.4.6 石榴花水提物對小鼠耳郭腫脹的影響 取小鼠25只，每組5只。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，試驗前小鼠禁食不禁水12 h，隨機(jī)分為模型對照組[生理鹽水10 mL/(kg·bw)]，陽性對照組[地塞米松600 mg/(kg·bw)]，PEW高劑量組(每只500 mg/mL)，PEW中劑量組(每只100 mg/mL)，PEW低劑量組(每只50 mg/mL)。以上各組連續(xù)灌胃7 d，0.5 mL/只，1 次/d。最后1 d給藥1 h后，將100%二甲苯0.2 mL均勻涂抹于每只小鼠左耳郭兩面致炎，右耳做對照。30 min以后頸椎脫臼處死，剪下雙耳，采用直徑為7 mm的打孔器在左右耳的同樣部位打下耳片。電子天平稱量，以耳片的質(zhì)量差作為耳腫脹度，計算腫脹抑制率[13]。

耳腫脹度=左耳耳片質(zhì)量-右耳耳片質(zhì)量

耳腫脹抑制率=(模型組腫脹度-給藥組腫脹度)/模型組腫脹度×100%

1.4.7 統(tǒng)計分析 計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)以Means±SE表示，用SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 石榴花水提物對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的安全濃度 如圖1所示，與空白對照組相比，PEW在濃度125 μg/mL時對細(xì)胞活力無顯著影響(P>0.05)，表明PEW在此濃度對細(xì)胞無毒性作用。與空白對照組相比，當(dāng)PEW濃度在62.5 μg/mL和31.25 μg/mL時，細(xì)胞活力明顯上升(P<0.05)，表明PEW在此濃度范圍內(nèi)可提高細(xì)胞增殖能力且不會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。因此根據(jù)上述結(jié)果，在后續(xù)試驗中將PEW的添加濃度確定為100、50 μg/mL和10 μg/mL，分別為高劑量組、中劑量組、低劑量組。

2.2 石榴花水提物對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放NO的影響 如圖2所示，與空白對照組相比，LPS炎癥模型組NO含量顯著升高(P<0.05)，與LPS炎癥模型組相比，PEW均能顯著降低小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NO含量(P<0.05)，高劑量組抑制效果最佳。

圖2 石榴花水提物對LPS 誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清液中NO含量的影響Fig.2 Effect of pomegranate flower water extract on NO content in supernatant of LPS induced mouse peritoneal macrophage

2.3 石榴花水提物對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6的影響 如圖3所示，與空白對照組相比，LPS組能使IL-6、TNF-α分泌量顯著升高(P<0.05)；與LPS炎癥模型組相比較，PEW高、中、低組顯著降低了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的IL-6分泌量(P<0.05)， 同時，PEW高、中劑量、低劑量組顯著降低了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的TNF-α分泌量(P<0.05)。

圖3 石榴花水提物對LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞促炎性細(xì)胞因子含量的影響Fig.3 The effects of pomegranate flower water extract on the content of pro-inflammatory cytokines in LPS induced mouse peritoneal macrophages

2.4 石榴花水提物對小鼠耳郭腫脹的影響 結(jié)果如表1所示，與模型對照組相比，PEW高劑量組能顯著抑制小鼠耳郭腫脹(P<0.05)，并且高劑量組的抑制效果最好；與陽性對照組相比較，高、中、低劑量組無顯著差異(P>0.05)。

表1 石榴花水提物對二甲苯致小鼠耳郭腫脹的影響Table 1 Effects of PEW on auricle swelling induced by xylene in mice

3 討論

植物提取物評估先決條件是確保植物提取物的毒性作用受細(xì)胞、代謝或信號通路的影響，從而抑制促炎因子的產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用，通常，后者為藥物的真實藥效表現(xiàn)。故在藥物無毒劑量下進(jìn)行試驗是考察藥物藥效的基礎(chǔ)[14]。本試驗通過MTT法檢測PEW對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響，結(jié)果顯示，PEW在125～31.25 μg/mL對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞無毒害作用，在62.5 μg/mL和31.25 μg/mL吸光度的顯著升高是因為該濃度下PEW能夠刺激巨噬細(xì)胞分泌大量琥珀酸脫氫酶(SDH)，巨噬細(xì)胞數(shù)量雖未發(fā)生變化，但巨噬細(xì)胞的活性增強(qiáng)及大量SDH的分泌導(dǎo)致該濃度下吸光值的升高。

LPS可有效激活巨噬細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，從而使相關(guān)炎性基因和蛋白的表達(dá)發(fā)生改變，促使巨噬細(xì)胞合成并分泌多種炎性因子如TNF-α、NO、IL-6和MCP-1等[15]。NO是一種多功能介質(zhì)，參與大量的病理和生理過程。巨噬細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞受到刺激時會產(chǎn)生大量NO。NO是巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬功能的基本條件，隨著NO的增加，巨噬細(xì)胞具有更強(qiáng)的吞噬功能[16]。TNF-α是巨噬細(xì)胞被激活時產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，是在炎癥反應(yīng)中產(chǎn)生最早的炎癥介質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體受到LPS刺激時多個臟器可迅速大量地合成TNF-α，進(jìn)而加強(qiáng)中性粒細(xì)胞的趨化作用，并與機(jī)體隨后合成的細(xì)胞因子IL-6等協(xié)同作用，從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞活性并擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[17]。IL-6是炎癥發(fā)生過程中重要的細(xì)胞因子，能與其他炎性因子起到協(xié)同作用，放大炎癥反應(yīng)，從而對機(jī)體造成損傷，可作為判斷炎癥反應(yīng)程度的指標(biāo)[18]。王翠芳等[19]研究表明，35%和75%乙醇洗脫沙蔥黃酮均能極顯著降低經(jīng)LPS刺激下巨噬細(xì)胞NO的分泌，且具有劑量依賴性。韓璐等[20]通過試驗表明，當(dāng)紫錐菊不定根提取物濃度為50 μg/mL時，NO的釋放量顯著低于LPS組，這表明紫錐菊不定根同樣具有抗炎作用。王翠芳等[19]研究表明，35%乙醇洗脫沙蔥黃酮通過調(diào)節(jié)NO、TNF-α和IL-6炎癥介質(zhì)的生成發(fā)揮抗炎癥作用。本試驗結(jié)果顯示，PEW在100 μg/mL和50 μg/mL時，均能顯著抑制LPS誘導(dǎo)炎癥模型巨噬細(xì)胞NO、TNF-α、IL-6的分泌，故說明PEW可通過調(diào)節(jié)NO、TNF-α、IL-6炎癥介質(zhì)的生成發(fā)揮抗炎作用。

炎癥是在致炎因素作用下，具有血管系統(tǒng)的活體組織對損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng)。首先表現(xiàn)為局部血管擴(kuò)張，毛細(xì)血管通透性增加，病程稍長則出現(xiàn)組織變性和纖維化。王思蘆等[21]研究表明，中、高劑量明日葉均能顯著降低二甲苯所致小鼠耳腫脹程度，小鼠的耳片病理切片觀察，中、高劑量組的耳切片白細(xì)胞數(shù)量明顯較少，腫脹較輕等組織變化，表明明日葉具有提高機(jī)體體液免疫及抗炎的功能。本試驗結(jié)果顯示，PEW高劑量組對二甲苯致小鼠耳郭腫脹的抑制可高達(dá)60%，說明PEW起到了抗炎的功效。

綜上所述，通過體內(nèi)外炎癥模型試驗可知，PEW通過提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能、影響細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌，從而發(fā)揮良好的抗炎活性作用，因此，認(rèn)為PFW可以作為治療炎癥相關(guān)疾病的抗炎藥，但其有效成分及分子作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。