豬多病原混合感染病例的診斷

韓 旭 ， Eager Wayne Johnson ， 夏兆飛

(1.中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 北京恩睿康農業技術咨詢有限公司 ， 北京 昌平 102209)

北京地區某個500頭母豬場，2019年10月保育豬死亡率高達4%。主要表現為斷奶后2周開始出現明顯呼吸道癥狀，噴嚏、咳嗽、腹式呼吸，體溫升高至40～40.5 ℃，精神沉郁，厭食，個別母豬有輕度腹瀉。送檢4頭35～55日齡保育豬進行剖檢。

1 剖檢病變及樣品采集

4頭病豬的肺臟均有不同程度的肉樣變，2頭豬鼻腔有膿性分泌物，提示可能有細菌感染，應進行細菌學和病理學檢查。4頭豬腹股溝淋巴結有不同程度的腫大，應進行PCR及病理學檢查。1頭豬結腸襻嚴重水腫、充血、輕度出血，應進行細菌學和病理學檢查。其他器官未見眼觀可見病變。

細菌分離培養樣品：肺臟、鼻腔膿汁、關節液及腦組織。PCR檢測樣品：肺臟及淋巴結。病理學檢查樣品：肺臟間葉、心葉、膈葉，大腦、小腦、扁桃體、心肌、肝臟、脾臟、腎臟、淋巴結、胃、十二指腸、空腸、回腸、結腸，均置于10%福爾馬林溶液中固定。

2 細菌學檢查

將用于細菌培養的組織接種于血平板、CNA平板(血平板加入萘啶酸及硫酸黏桿菌素以選擇性培養革蘭陽性菌)、麥康凱平板進行細菌分離培養，培養基購自Oxiod公司，并自行配置。

經檢查，從1頭豬的肺臟及鼻腔膿汁中分離到β溶血性針尖狀小菌落，革蘭染色鏡檢為革蘭陽性球菌，疑為鏈球菌。對疑似菌落進行PCR擴增16S rRNA片段并測序，使用細菌通用型引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[1]，測序可知溶血性小菌落為豬鏈球菌(Streptococcussuis)。參照Okura等建立的兩步多重PCR方法對分離到的鏈球菌進行血清型檢測[2]。參照King等建立的鏈球菌多位點序列分型(MLST)檢測方法進行基因型檢測[3]，對aroA、cpn60、dpr、gki、mutS、recA、thrA共7個管家基因進行PCR和Sanger測序，其中鏈球菌mutS基因改用Rehm等設計的改進型引物[4]。測序服務由美吉生物提供。進一步將測序結果上傳至PubMLST進行比對分析以確定其基因型。經檢測同一頭豬感染了2種豬鏈球菌，肺臟感染的鏈球菌血清型為3型，基因型為ST117。鼻腔膿汁分離到的鏈球菌血清型為2型或1/2型，基因型為ST28。采用紙片擴散法對2株鏈球菌進行藥敏試驗，選用的藥物為慶大霉素(CN)、土霉素(OT)、替米考星(TIL)、恩諾沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、阿莫西林克拉維酸鉀(AMC)、磺胺甲噁唑-甲氧芐啶(SXT)、大觀霉素(SH)、阿莫西林(AML)、青霉素(P)、磺酰胺(S3)、頭孢氨芐(CL)、甲硝唑(MTZ)，藥敏紙片均購自Oxoid公司，敏感藥物為恩諾沙星和氟苯尼考。

嚴重水腫的結腸組織于麥康凱培養基上分離到大腸桿菌。致病性大腸桿菌可造成仔豬腹瀉和斷奶后保育豬水腫病，特別是大腸桿菌水腫病可造成腸水腫，但大腸桿菌又是結腸內的常在菌，且采樣時易被環境污染。分離到的大腸桿菌是否為致病菌，需進一步鑒定是否具有腸絨毛黏附因子和毒力因子。檢測的黏附因子包括5種菌毛(F4、F5、F6、F41、F18)和彌漫性黏附素AIDA。毒力因子包括熱穩定毒素STa和STb，熱敏感毒素LT，志賀毒素Stx2e。使用PCR方法進行檢測，黏附素AIDA參照Cote等的方法[5]，其他黏附及毒力因子參照Larsson等的方法[6]。挑取多菌落進行PCR，結果在陽性對照都成立的情況下，所有黏附因子及毒力因子均為陰性，說明結腸分離到的大腸桿菌應為非致病菌，不是結腸水腫的病因。

3 常見病毒PCR檢查

病毒PCR檢測結果：對檢測樣品進行RNA和DNA的提取并檢測常見病毒：豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環病毒2型(PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)，所用的提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit及檢測試劑盒QIAGEN OneStep RT-PCR Kit均購自QIAGEN公司；所用引物均為本試驗自行設計(表1)，反應體系及擴增條件參照試劑盒推薦流程。檢測結果為PRRSV及PCV2陽性，其余為陰性。分別對PRRSVORF5片段和PCV2ORF2片段進行PCR擴增并測序，經比對分析后發現，PRRSV為中國高致病性HP-PRRSV-like樣毒株，該毒株與1年前從該場檢測到的PRRSV毒株ORF5片段同源性100%，應為同一毒株。PCV2為PCV2 d型毒株，該型毒株為國內主要的流行毒株[7-8]。

表1 病毒引物序列

4 病理學檢查

將固定好的組織樣品制作成石蠟切片并進行H.E.染色。可見肺臟表現為間質性肺炎，肺泡腔內可見嗜酸性壞死團塊，懷疑為PRRSV感染所致。肺泡腔、支氣管、細支氣管腔內可見大量中性粒細胞，懷疑為豬鏈球菌感染所致。淋巴結及脾臟淋巴細胞缺失，淋巴結可見嗜堿性葡萄串樣核外包涵體，懷疑為PCV2引起的免疫組織損傷。結腸可見嚴重的黏膜下水腫，腸黏膜層出血、壞死。結腸黏膜層表面抹片后革蘭和吉姆薩染色，鏡檢可見螺旋狀細菌，懷疑為豬痢疾短螺旋體或結腸絨毛樣短螺旋體。因結腸菌群組成復雜，短螺旋體生長緩慢、厭氧且易被過度生長的腸道厭氧菌抑制生長，所以未能成功分離到短螺旋體。見封底彩版圖1。

5 診斷與治療

綜合診斷分析表明，豬群呼吸道癥狀主要由于PRRSV和鏈球菌感染引起，但究竟哪一種病原菌很難確定。鑒于該場既往病史，同一種PRRSV毒株長期存在于該場，保育豬并未出現明顯臨床癥狀，保育舍死亡率為1%～2%，所以懷疑豬鏈球菌為主要病因，PRRSV參與致病。根據藥敏試驗結果，建議保育舍飼料中添加氟苯尼考250 g/t，飼喂2周。發病豬肌內注射恩諾沙星7.5 mg/(kg·bw)，每24小時注射1次，連續注射3次以上。

病弱豬有圓環病毒2型造成的免疫組織損傷，建議圓環病毒2型疫苗免疫由原來的21日齡免疫1次改為7日齡、21日齡各免疫1次。圓環病毒2型疫苗為滅活苗，雖添加有緩釋佐劑，但2次免疫仍優于1次免疫。

結腸中發現有短螺旋體存在，且造成了腸道損傷。建議保育飼料中添加泰妙菌素300 g/t，連續添加2周。因豬群整體只有輕微的腹瀉，懷疑為結腸絨毛樣短螺旋體，豬痢疾端螺旋體造成的腹瀉應更加嚴重，發生血便。進一步研究可設計特異性引物檢測腸道內容物以區分2種短螺旋體[9]，因該場腹瀉癥狀輕微，所以未做進一步檢測。該場使用發酵床養豬，發酵床墊草如處理不當，發酵不完全無法殺死有害病原微生物，此時易發生腸道細菌及寄生蟲持續感染。

執行推薦措施10 d后豬群穩定，無新發病例，保育豬死亡率重新控制在2%以內。

6 討論

本案例中同一頭豬發現了2種不同血清型及基因型的豬鏈球菌，說明多種鏈球菌可同時感染同一個體，不同的鏈球菌可能有不同的組織嗜性，本案例中一種感染鼻腔，另一種感染肺臟。這一情況提示我們，臨床中對于疑似鏈球菌感染的病例，應對肺臟、鼻腔、關節腔、大腦及小腦進行分開采樣、分離、培養、鑒定，防止多種鏈球菌感染時漏檢，不同的鏈球菌藥物敏感性可能不同，所以選用的治療藥物可能也不同。鏈球菌的感染通常為呼吸道感染及外傷感染，呼吸道感染途徑為口鼻的接觸傳播和短距離空氣傳播，外傷感染途徑為剪牙、斷尾、斷臍、四肢外傷、不潔的肌肉注射等方式。臨床剖檢時應予以關注，嘗試找出主要感染途徑。鏈球菌血清型和基因型的檢測有利于疾病進程的追蹤，當再次發病時可確定是否為新菌種感染，還是原菌種發生了耐藥變異。病毒的測序也有相同作用，可在分析毒株致病性的同時追蹤疾病進展。

通常呼吸道疾病高發于秋冬季，天氣轉冷，豬場通常為了保證圈舍溫度而降低圈舍通風量，這就造成空氣中的PRRSV、鏈球菌等致病菌在環境中富集，引起豬群發病。因此秋冬季注重保溫的同時更應關注通風管理，現代化的豬舍應有自動化控制的通風設備，根據豬群日齡保證舍內的最小通風量。

病理學檢查在臨床診斷中具有十分重要的意義，發現的病原菌是否造成了組織損傷，應進行病理學檢查。本案例中肺部的間質性肺炎和嗜酸性壞死團塊，與PCR-PRRSV陽性相互佐證。支氣管及肺泡內大量的中性粒細胞與細菌分離培養得到豬鏈球菌相互佐證。回腸出血、壞死、水腫與細菌學檢測短螺旋體陽性、致病性大腸桿菌陰性互相佐證。淋巴組織中淋巴細胞缺失、嗜堿性核外包涵體與PCR-PCV2陽性相互佐證。PCV2在國內豬場普遍感染[7-8]，是否發病應結合病理學損傷及臨床癥狀進行評估。

豬群疾病的診治應將病史、現場情況、剖檢、細菌學、分子生物學、組織病理學診斷有機的結合起來，每種檢測方式都有相應的優勢和劣勢，應注重綜合診斷，不同方法間相互補充，互相驗證，去偽存真。