仔豬沙門菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和圓環病毒混合感染的報道

鄧同煒 ， 王成龍 ， 馮蘭珠 ， 蔣增海 ， 李文剛

(1.河南牧業經濟學院動物醫藥學院 ， 河南 鄭州 450046 ； 2.河南省豬病防控工程技術研究中心 ， 河南 鄭州 450046)

仔豬副傷寒，又稱為豬沙門菌病，是由鼠傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌、豬傷寒沙門菌等多種病原引起的一種重要的人獸共患病[1]。近年來，關于豬繁殖與呼吸綜合征病毒與圓環病毒混合感染的報道較多[2-4]，但是由沙門菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和圓環病毒三者的混合感染報道卻極少[5]。筆者于2018年10月接診1例病豬，通過臨床診斷和實驗室檢測，確定為仔豬沙門菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和圓環病毒混合感染，報告如下。

1 發病情況

河南省濮陽市清豐縣某一自繁自養、中小型豬場，存欄繁殖母豬約30余頭。在最近1～2周內，各年齡段的豬只均有發病，尤其母豬和仔豬發病較為嚴重，其中1頭妊娠母豬發病后死亡，另外1頭妊娠母豬在懷孕后期產死胎；仔豬的發病數較多，1周之內已經有2頭死亡。為了確診病因，該場養殖戶送檢1頭發病仔豬和幾頭發病母豬的血清樣品到本實驗室進行化驗檢測。經過詢問，了解到該豬場未進行豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環病毒疫苗的免疫接種，僅按照要求進行了豬瘟病毒、偽狂犬病病毒等疫苗的免疫接種。

2 臨床癥狀

多數母豬表現為精神不振，體溫升高，嗜睡，厭食，所有發病的母豬使用退燒藥和青霉素注射后，出現體溫反彈，病情不見好轉。其中1窩斷奶仔豬，總共12頭，全部發病，臨床癥狀表現為精神不振，發熱，腹式呼吸，拉稀，消瘦，皮膚發白，排出黃色稀便，發病1周左右開始死亡。

3 病理剖檢變化

送檢病豬剖檢后，可見肺臟有肉變區，表面有出血點，頜下淋巴結腫大，腹股溝淋巴結腫大出血，小腸腸管膨大、充滿黃色內容物，腸系膜淋巴結索狀腫大(中插彩版圖1)，脾臟腫大、切面外翻(中插彩版圖2)，腎臟針尖狀出血點。

4 實驗室檢測

4.1 病毒的PCR/RT-PCR檢測 圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒特異性引物，由本實驗室趙攀登博士惠贈，其序列分別為 PCV-2-F 5′-CACGGATATTGTAGTCCTGGT-3′，PCV-2-R 5′-CGCACCTTCGGATA-TACTGTC-3′，擴增片段大小為494 bp；PRRSV-F 5′-ATGGCCAGCCAGTCAATCA-3′，PRRSV-R 5′-TCGCCCT-AATTGAATAGGTG -3′，擴增片段大小為434 bp。采集送檢仔豬肺臟、淋巴結等病料，加入一定量滅菌PBS研磨，凍融1～2次，離心取上清，按照 HiPure Universal DNA Kit提取試劑盒或者HiPure Viral RNA Kit試劑盒說明書要求提取病毒DNA或RNA，根據2× PCRTaqMaster Mix with dye(Abm公司產品)、TaKaRa One Step RNA PCR Kit(TaKaRa公司產品)要求,進行圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的PCR/PT-PCR特異性片段擴增。

結果顯示，待檢樣品分別擴增出494 bp、434 bp的條帶，與圓環病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性對照的擴增條帶大小結果一致，去離子水作為陰性對照未擴增出條帶(圖3)，表明病料中圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒檢測結果均為陽性。

圖3 圓環病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的PCR結果1：DNA marker； 2：陰性對照； 3：圓環病毒陽性對照； 4：待檢樣品； 5：陰性對照； 6：豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性對照； 7：待檢樣品

4.2 細菌的分離培養、染色鏡檢 無菌采集心臟血液，稀釋劃線接種于巧克力瓊脂平板，37 ℃ 培養24 h， 均生長出一種圓形、半透明、凸起、大小均勻一致的1～2 mm菌落，外觀比較純，沒有雜菌生長。挑取單菌落，接種于麥康凱瓊脂平板，進一步純化2～3代， 生長為無色至淺橙色，透明或半透明，圓形，邊緣整齊，濕潤菌落。革蘭染色、鏡檢可見革蘭陰性菌、中等大小、無芽孢的短桿菌(中插彩版圖4)，疑似沙門菌。

4.3 分離細菌的PCR鑒定 挑取單菌落，接種于營養肉湯中，37 ℃過夜培養，水煮法提取細菌DNA模板。PCR擴增參照文獻[6]進行，上游引物Sal1:5′-CAGGATACCTATAGTGCTGC-3′，下游引物Sal2：5′-CGCACCGTCAAAGGAACCGT-3′。PCR反應體系：PCR Master Mix 10 μL,上游引物 0.5 μL,下游引物 0.5 μL，滅菌的超純水 8 μL，模板 1 μL。擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性 30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s，35 個循環；72 ℃ 延伸 10 min，PCR擴增產物進行1%瓊脂凝膠電泳分析。結果顯示，分離菌擴增條帶與預期條帶(580 bp左右)一致，去離子水作為陰性對照未見擴增條帶(圖5)，表明分離菌株為沙門菌。

4.4 藥敏試驗 選取15種藥物，以大腸埃希菌 (ATCC25922)為質控菌株，采用K-B紙片瓊脂擴散法，對該分離菌株進行藥敏試驗。從麥康凱平板上挑取純化的單個菌落，接種于營養肉湯中，37 ℃過夜培養，比濁法將菌液濃度調為0.5麥氏濃度，用滅菌過的棉簽蘸取菌液，均勻涂抹于MH瓊脂平板，貼上藥敏片，在37 ℃恒溫箱培養18～24 h，測定抑菌圈直徑。

藥敏試驗結果表明，該分離菌株對氨芐西林、紅霉素、四環素、氯霉素均耐藥，對環丙沙星、慶大霉素、頭孢曲松、亞胺培南、美羅培南、多黏菌素B、阿米卡星、頭孢他啶等藥物敏感，對阿莫西林-克拉維酸、頭孢唑啉、卡那霉素中介，如表1所示。

表1 藥敏試驗結果

5 討論

根據該豬場發病仔豬的臨床表現、病理變化以及實驗室檢測結果，同時妊娠母豬表現為發燒、嗜睡、流產等癥狀，最終確診為仔豬沙門菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環病毒的混合感染。本次發病的癥狀和病變，也可能懷疑為豬瘟，為此，筆者對送檢的仔豬病料還進行了豬瘟病毒的RT-PCR檢測，結果為豬瘟病毒陰性。

為進一步對發病母豬進行確診，筆者采用IDEXX公司生產的PRRSV ELISA檢測試劑盒，對送檢的7頭發病母豬的血清進行了豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測，顯示共有5頭病豬為豬繁殖與呼吸綜合征抗體陽性，結合臨床癥狀表現，表明本次母豬發病很可能為豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染所導致，因為豬繁殖與呼吸綜合征病毒具有抗體依賴增強作用。

該豬場接種了豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒疫苗，并未接種豬繁殖與呼吸綜合征病毒和圓環病毒疫苗，豬群缺乏抗病能力，是引起本次發病的根本原因。由于豬繁殖與呼吸綜合征病毒和圓環病毒感染均無特效藥物治療，可使用一些中藥，如黃芪多糖、板藍根、大青葉等對癥治療，同時使用抗菌藥物控制繼發感染，對病豬或帶菌豬的排泄物及污染的飼料、飲水、用具、食槽和圈舍等,要用2%～4%火堿溶液或10%～20%石灰乳進行徹底消毒。

仔豬副傷寒是由沙門菌引起，主要危害1～4月齡仔豬，長途運輸、天氣突變、飼料更換、陰雨天氣等因素可以誘發本病。本次病例仔豬的發病，可能是由于在斷奶應激因素的作用下，加上豬繁殖與呼吸綜合征病毒、圓環病毒混合感染，誘發沙門菌感染所導致。藥敏試驗結果表明，分離菌株對環丙沙星、慶大霉素等藥物敏感，可作為治療藥物使用，但是對四環素、氨芐西林或者氯霉素均耐藥，不能作為治療藥物，氯霉素屬于禁用藥物，作為同一類藥物的氟苯尼考可能也具耐藥性，因此也不能選為治療藥物。