副雞禽桿菌引起蛋雞腫頭病例的診治

王馨玉 ， 劉激雨 ， 張 鑫 ， 張鴻宇 ， 胡君宜 ， 曲潤康 ， 蓋新娜 ， 郭 鑫 ， 孫洪磊

(中國農業大學動物醫學院 農業部動物流行病學重點實驗室 ， 北京 海淀 100193)

近年來，隨著我國家禽養殖業集約化、規模化發展，雞多病因呼吸道疾病成為冬春寒冷季節的常發疾病[1]。該類疾病的主要臨床表現為病雞呼吸困難、氣管啰音，生長發育受阻，產蛋率降低；主要病理變化為鼻竇分泌物增多，喉頭、氣管黏膜充血、出血，肺臟淤血、水腫，氣囊炎，兼有其他內臟器官病變。該類疾病的發生與應激因素刺激有關，誘發病毒、細菌、支原體等病原體混合感染。引起雞多病因呼吸道疾病的病原主要包括禽流感病毒、新城疫病毒、禽偏肺病毒、傳染性支氣管炎病毒、雞毒支原體、副雞禽桿菌和巴氏桿菌[2]。上述病原感染引起臨床癥狀的相似性，給疾病的確診帶來困難，且不利于快速制定針對性治療方案。現以一起由副雞禽桿菌引起的蛋雞腫頭病例的診斷為例，為雞多病因呼吸道疾病的鑒別診斷提供參考。

2019年1月初，河北省石家莊地區多家商品蛋雞養殖場的產蛋雞發生以面部腫脹、呼吸困難為主要特征的病癥，該病發生后迅速蔓延至全群，1周后腫頭癥狀好轉，但蛋雞產蛋量急劇下降并難以恢復，對養殖場造成較大的經濟損失。結合對3家發病雞場的臨床診斷和實驗室診斷，確定引起此病癥的病原為血清B型的副雞禽桿菌，將診斷過程報告如下。

1 發病情況與臨床癥狀

2019年1月，河北省石家莊地區多家商品蛋雞養殖場的產蛋期蛋雞先后出現不明原因的腫頭癥狀，病情發展迅速，發病率高達30%～60%，死亡率約為5%。發病初期雞只精神不振、食欲減退、面部水腫，伴有甩頭、打噴嚏、流漿液性鼻涕、張口呼吸等癥狀，部分病情嚴重雞只顏面紅腫，眼瞼腫脹甚至失明，呼吸困難有啰音，鼻孔外結痂(中插彩版圖1A)。發病1周后，雞只的腫頭癥狀減輕，但產蛋量大幅下降，出現軟殼蛋和畸形蛋。發病雞場均已免疫禽流感、新城疫、雞傳染性支氣管炎疫苗及副雞禽桿菌滅活苗(A+C型或A+B+C型)。

2 病理剖檢變化及組織病理學觀察

對病雞進行剖檢觀察，顏面部皮下、眶下竇內可見大量黃白色膠胨樣滲出(中插彩版圖1B)；鼻腔內有黏液，鼻甲部存在大量呈灰白色黏液狀或黃白色干酪樣的滲出物(中插彩版圖1C)；氣管、肺臟未見明顯病變。病雞卵泡充血、出血、液化、變形，成熟卵泡數量少(中插彩版圖1D)；盲腸扁桃體腫脹出血，部分病雞十二指腸淋巴濾泡腫脹。

取病變的鼻甲部組織，使用蘇木精伊紅染色法(H.E.染色法)制成組織病理切片，經顯微鏡觀察可見鼻竇內有大量黏液及纖維素滲出，混有大量紅細胞及炎性細胞(中插彩版圖2A～2B)；鼻竇黏膜上皮細胞腫脹、增生，黏膜固有層大量淋巴細胞、巨噬細胞以及肥大細胞浸潤，血管充血(中插彩版圖2C～2D)。

3 實驗室診斷

3.1 病原檢測 對腫頭癥狀較為嚴重的病雞進行檢測樣本的采取，共采集包括病雞口咽拭子、眶下竇、鼻甲、氣管、肺臟、腎臟和氣管灌洗液在內的20份樣品，并使用研磨儀將樣品充分研磨勻漿。提取上述樣品的總RNA并進行反轉錄，將反轉錄后的cDNA作為模板，分別使用禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、禽偏肺病毒的特異性引物進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，發現以上檢測結果均呈陰性。提取上述樣品的DNA作為模板，使用副雞禽桿菌的特異性引物進行PCR擴增(上游引物：5′-GAAAAAGATGGTAGCCGTGT-3′，下游引物：5′-TAACCGCATCACATTTCG-3′,擴增片段長度為462 bp)，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖3所示，共有12份樣品(10份鼻甲組織研磨液，2份氣管灌洗液)擴增出與目的長度相符的條帶。將上述陽性樣品送至北京擎科新業有限公司進行序列測定，將測定結果與NCBI數據庫中副雞禽桿菌的參考序列進行同源性比對分析，結果顯示，陽性樣本的基因序列與副雞禽桿菌參考株(VRDC/AvpgHNS/SZ)基因序列同源性達99.0%。

圖3 副雞禽桿菌特異性PCR檢測結果1～19：待檢病料樣品； 20：陰性對照； M：5 000 bp marker

3.2 細菌分離培養及血清型鑒定 取病雞鼻甲組織研磨液劃線接種含有雞血清和還原型輔酶I的TSA瓊脂平板，于37 ℃、5% CO2條件下培養18～20 h后，可見灰白色、半透明、針尖大小菌落，進行革蘭染色鏡檢可見革蘭陰性小桿菌。挑取單菌落純化培養，共得到2株分離菌株。參照Page凝集試驗分型法，將純化的菌株分別與A、B、C型3種標準陽性血清進行平板凝集試驗，結果顯示，2株分離菌均為Page B型。

4 討論

結合病雞的臨床癥狀、剖檢病變以及病原的分離鑒定和分型結果，確診引起該病的病原為副雞禽桿菌。副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum)屬于巴氏桿菌科、禽桿菌屬、副雞禽桿菌種[4]，可引起雞急性上呼吸道感染，主要臨床癥狀為鼻腔和鼻竇的炎癥，同時伴有流涕、顏面腫脹、結膜炎等癥狀[5]。本病潛伏期短、傳播迅速，發病率高、死亡率低，可造成育成雞群生產停滯、淘汰率增加以及蛋雞群產蛋率的顯著下降[6]。Page等使用全細菌平板凝集試驗和雞的抗血清將副雞禽桿菌分為A、B和C三個血清型[7-8]，各血清型之間無交叉保護性[6]。我國于1986年由馮文達在北京首次分離到副雞禽桿菌，經鑒定為Page A型[9]，此后Page B型和C型雞嗜血桿菌的分離情況也陸續被報道[10-11]。流行病學調查顯示，近年來我國雞傳染性鼻炎的流行呈上升趨勢，優勢血清發生了從Page A型到Page B型的轉換[12-13]。本病例中分離到的2株副雞禽桿菌都屬Page B型，進一步佐證了流行病學的調查結果。

由副雞禽桿菌引發的疾病有明顯的季節性，多發生于冬春季節，這與寒冷季節禽舍內“重保溫，輕通風”的不良管理方式有較大關聯。禽舍內空氣不流通導致氨氣濃度過高，刺激蛋雞呼吸道，降低了其對副雞禽桿菌的免疫力。被副雞禽桿菌感染的病雞出現流淚、鼻塞、顏面腫大等癥狀，在其頻繁抓撓鼻部的過程中易繼發感染墊料和環境中的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。在原發和繼發病原的共同作用下，病理反應產物堵塞上呼吸道，病雞出現高熱、呼吸困難和明顯的腫頭癥狀。因此，為預防該病的發生，養殖場應加強飼養管理，尤其注意禽舍的通風、衛生情況。

疫苗的免疫失敗也是導致本病發生的不可忽視原因。副雞禽桿菌各血清型之間的交叉保護性較弱，目前我國廣泛使用副雞禽桿菌二價或三價滅活疫苗，但其保護效果因菌株與流行血清型匹配程度及免疫原性的好壞而存在差異。在本病例中，發病雞場均已免疫過副雞禽桿菌滅活苗(A+C型或A+B+C型)，但至冬季仍發生疫情，說明疫苗菌株與當地流行菌株的血清型差異較大，保護效果不佳。流行病學調查和本病例的診斷結果顯示，目前我國所流行的副雞禽桿菌以B型為主，其對蛋雞有較強的致病力[13]，因此研發針對B型或A、B、C三型流行菌株的高保護力疫苗對于副雞禽桿菌的控制十分重要[14-15]。此外，副雞禽桿菌主要感染壽命較長的蛋雞，滅活疫苗僅可在短時間內提供保護，且目前對傳染性鼻炎菌素的免疫持續時間的研究較少[15]。因此，及時監測抗體水平，探究疫苗能提供良好保護水平的時間，以制定科學合理的免疫程序，也是未來防控過程中必不可少的一環。

由副雞禽桿菌引起的腫頭病癥潛伏期短、發病迅速，腫頭和呼吸道癥狀易與低致病性禽流感、禽偏肺病毒病、大腸桿菌病和雞傳染性支氣管炎等病癥混淆，發病早期的錯誤診斷，是造成疾病遷延不愈、病雞產蛋量下降的重要原因。因此，在診斷時應注意結合本病發病率高、死亡率低的流行病學特點，可采用病料涂片鏡檢和特異性PCR相結合的方法進行快速診斷。根據診斷結果，對發病雞群緊急免疫相應血清型疫苗并聯合應用抗生素藥物，可使病情得到有效控制。