狐β-防御素基因的組織分布及表達特性

劉陶林 ， 張宜宸 ， 何季竺 ， 羅陵琳 ， 張含煜 ， 劉志平 ， 田麗紅

(東北林業大學野生動物與自然保護地學院 ， 黑龍江 哈爾濱 150040)

β-防御素(Beta-defensin,DEFB)是哺乳動物體內一類重要的抗菌肽，廣泛分布于黏膜上皮細胞和中性粒細胞中，是機體先天性免疫和獲得性免疫的重要組成部分[1]。β-防御素具有廣譜的抗微生物活性，對細菌、真菌、螺旋體和病毒均有殺滅作用，因其具有獨特的抗菌機理，且不易產生耐藥及藥物殘留等優勢，被認為是抗生素或抑菌活性藥替代品的潛力藥物[2]。此外，β-防御素還可以作為機體體內免疫應答的重要調控因子，通過多種方式調節宿主免疫炎癥反應，包括增強巨噬細胞吞噬作用，加快中性粒細胞激活補體，促進樹突狀細胞和T細胞的成熟等[3]。近年來，大量β-防御素被發現在哺乳動物雄性生殖系統中表達，參與對抗生殖系統微生物的感染，維持附睪上皮、附睪腔內的環境穩定，同時參與精子成熟和受精[4]。研究發現，一些哺乳動物β-防御素可與精子結合，調節精子向前運動能力[5]，參與精子獲能[6]，調節精子與輸卵管上皮細胞結合能力，保障精子穿越宮頸黏液[7]，參與動物有效生殖。

狐作為我國重要的特種毛皮經濟動物[8]，養殖量逐年上升，疾病預防和有效繁殖直接關系到養殖經濟效益，狐β-防御素(Vulpeslagopusbeta-defensins，vBDs)的相關研究對狐病原體感染性疾病防治和提高生殖性能均具有重要意義，但有關vBDs的研究在國內外鮮有報道，對vBDs生物學功能的研究僅見于抗微生物活性上[9]，其是否還具有抗微生物之外的功能尚不清楚，而β-防御素在哺乳動物不同組織的廣泛分布，提示其可能具有多種生物學活性。為此，本試驗利用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法首次對vBDs在狐多種組織中的分布表達進行研究，為進一步研究vBDs的生物學功能提供基礎資料和科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DNA Marker DL-2 000、普通Taq酶、2.5 mmol/L dNTP Mix、6×Loading Buffer、GoldviewⅠ，均購自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖(Agarose)、通用植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)，均為北京百泰克生物技術有限公司產品；反轉錄試劑盒HiScript?ⅡQ RT Super Mix for qPCR (+gDNA wiper)，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒和固相Rnase清除劑，均購自東山(哈爾濱)生物科技有限公司；NaOH、NaCl、無水乙醇、氯仿等藥品均為國藥分析純。

1.2 實驗動物及樣本采集 65周齡健康雄性藍狐和赤狐，各5只，由哈爾濱華隆藍狐育種有限公司提供。依照國際動物福利法，對樣本狐采用過量戊巴比妥鈉Ⅵ進行安樂處死，取氣管、腸淋巴結、肺臟、肝臟、腎臟、脾臟、十二指腸、回腸、睪丸以及附睪共計10種組織，分別取樣浸泡于RNA保存液中，置于-80 ℃保存待用。

1.3 引物的設計和合成 根據GenBank上已發表的犬科動物β-防御素基因序列，使用Primer 5.0設計狐β-防御素基因擴增引物和內參基因GAPDH的擴增引物(表1)。

表1 狐β-防御素基因擴增引物Table 1 Primers for the foxes β-defensin gene

1.4 狐vBDs基因的RT-PCR檢測 利用總RNA提取試劑盒提取狐各組織樣本總RNA，用反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄成模板cDNA，PCR擴增vBDs基因。PCR反應程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、各vBDs基因退火溫度 30 s、72 ℃ 45 s，30個循環；72 ℃ 7 min。PCR產物經5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送吉林省庫美生物科技有限公司測序，并對10種β-防御素基因在10種組織中PCR檢測結果進行統計分析。

1.5vBD1和vBD2 mRNA的實時熒光定量PCR(qPCR)檢測 根據AceQ qPCR SYBR Green Master Mix熒光定量PCR試劑盒中的反應體系以及反應條件，以1.4中獲得的cDNA為模板，以表1所示為qPCR檢測引物，進行熒光定量PCR檢測vBD1和vBD2的表達。

2 結果

2.1 狐vBDs基因在組織器官中的分布 本試驗采用RT-PCR法，分別從65周齡藍狐和赤狐體內10個組織中擴增出10種vBDs基因。這些組織覆蓋了狐的消化系統、呼吸系統、泌尿生殖系統及其他組織。擴增出的基因片段大小均與預期相符，經測序后與犬相應β-防御素基因核苷酸序列比對分析，證實為狐vBDs基因。結果表明，vBD1基因在狐氣管、肝臟、腎臟和脾臟中表達；vBD2基因在肝臟、腎臟和十二指腸中表達；vBD3基因在狐各組織中表達較為廣泛，在肝臟、脾臟、淋巴結、十二指腸、睪丸和附睪中均有表達；vBD102基因僅局限于狐肺臟和睪丸中不穩定表達；vBD103基因在狐氣管、肺臟、肝臟、淋巴結和回腸中表達；vBD108基因在狐淋巴結、睪丸和附睪中表達；vBD122基因在狐腎臟、淋巴結、睪丸和附睪中表達；vBD123基因在狐脾臟、淋巴結、睪丸、附睪中不穩定表達；vBD124基因在睪丸和附睪中表達；vBD140基因在腎臟、睪丸和附睪中不穩定表達(表2)。其中vBD1和vBD2在肝臟和腎臟組織中穩定表達，vBD3、vBD108和vBD122于睪丸和附睪組織中穩定表達(圖1)。

圖1 vBDs基因在不同組織中的表達Fig.1 Expresstion of vBDs gene in different tissues0～4：5只赤狐樣本； 5～9：5只藍狐樣本； -：陰性對照； M：DNA DL-2 000 marker0-4:Samples of five red foxes; 5-9:Samples of five blue foxes; -:Negative control; M:DNA DL-2 000 marker

表2 vBDs基因的組織表達分布Table 2 Tissue gene expression profile of vBDs

2.2 藍狐肝、腎組織中vBD1、vBD2 mRNA表達水平分析 藍狐肝臟和腎臟中表達的2種vBDs(vBD1和vBD2)mRNA相對定量分析結果，如圖2所示，vBD1和vBD2 mRNA在腎臟中表達量均顯著高于肝臟中的表達量(P<0.01和P<0.000 1)；vBD1和vBD2 mRNA在腎臟中表達量分別是肝臟的1.37倍和7.31倍;而vBD1 mRNA在腎臟和肝臟中表達量均極顯著高于vBD2 mRNA的表達量(P<0.000 1),在腎臟中vBD1的表達量是vBD2的4.31倍，肝臟中vBD1的表達量是vBD2的23倍。

圖2 vBD1、vBD2基因在藍狐肝腎組織中的相對表達量Fig.2 Relative expression of vBD1、vBD2 mRNA levels in kidney and liver of blue foxes**: 差異顯著(P<0.01)； ****: 差異極顯著(P<0.000 1)**: Significant difference (P<0.01)； ****： Very significant difference(P<0.000 1)

3 討論

本試驗采用RT-PCR技術對狐10種vBDs基因在狐10個不同組織中的分布進行測定。結果顯示，vBD1和vBD2在肝臟和腎臟組織中穩定表達，且vBD1廣泛分布于氣管、肝臟、腎臟、脾臟等臟器。qPCR的結果顯示，腎臟和肝臟中vBD1的表達量均顯著高于vBD2，vBD1在肝臟與腎臟中優勢表達。肝臟和腎臟是不經常受到微生物威脅的器官，vBD1在其中大量表達，預示著vBD1可能具有其他生物學活性。研究發現，藍狐vBD1與人體重要的抗菌肽之一hBD1在氨基酸組成和蛋白三級結構存在較大程度相似性[9]，而Mehdi等[10]研究證實，hBD1基因多態性與腎結石的形成存在密切相關性，可能作為評估腎結石相關風險的指標，盡管其在腎結石患者中可能的病理生理作用尚不清楚。狐貍人工繁育中因飼料蛋白含量過高、飼料中微量元素不平衡、維生素缺乏及尿路感染等原因引發的腎結石在臨床上比較常見。vBD1在狐腎臟中穩定高表達提示其可能參與狐貍腎病的形成，但其是否通過直接干擾尿路感染的微生物或作為信號分子參與了腎結石形成，還需要進一步研究。

近年來，大量β-防御素被發現在哺乳動物雄性生殖系統中表達，既能有效參與機體抑菌抗炎作用，也能對生殖系統的炎癥反應起到調節作用[11]。豬睪丸中大量表達的β-防御素(Porcine beta defensins,pBD) pBD1和pBD2體外試驗均顯示，其對大腸桿菌的高效殺滅作用和對精子的保護作用，可以替代抗生素用于豬精子保存液的配置[12]。臨床上人類DEFB1缺陷體[13]，睪丸更易感金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等常見微生物。研究發現，人hBD-3[14]、獼猴DEFB126 (ESP13.2)[15]、大鼠rBD22和rBD15[7]、山羊gBD104a[16]和gBD124[17]等多種β-防御素樣蛋白可附著于精子或直接與精子結合。一些β-防御素基因的表達缺失會導致白細胞精液癥、弱精子癥等，β-防御素參與維持生殖系統功能穩定[13]。本試驗發現，vBD3、vBD108和vBD122于狐睪丸和附睪組織中穩定表達，提示其在公狐的生殖活動中具有重要作用，但其是否參與對抗生殖系統微生物的感染，維持附睪上皮、附睪腔內的環境穩定，發揮抑菌抗炎的作用，是否與精子結合，調節精子的功能，參與動物有效生殖還需要進一步的研究。