犢牛腹瀉沙門菌抗菌藥敏感性試驗與中藥體外抑菌試驗

劉勃興 ， 趙安奇 ， 柳翠翠 ， 康圓圓 ， 馬金換 ， 高桂生 ， 吳同壘 ， 史秋梅 ， 張志強

(河北科技師范學院 河北省預防獸醫學重點實驗室 ， 河北 秦皇島 066004)

腹瀉病是犢牛養殖過程中的常見疾病，導致犢牛腹瀉原因有許多，其中，沙門菌是該病的重要病原[1]。牛沙門菌病又稱牛副傷寒，7～28日齡犢牛易發病，主要臨床癥狀為發熱、腹瀉脫水、關節腫大等，嚴重時可引起敗血癥而死亡，是致犢牛腹瀉主要細菌病原之一。目前，臨床治療沙門菌所致犢牛腹瀉病以抗生素類為主，但隨著在臨床治療以及養殖過程中抗菌藥物的不合理應用，細菌耐藥問題日益嚴重，給細菌病的防治造成困難。因此，迫切需要篩選出有效的抗菌藥物指導臨床用藥。

中藥是我國的傳統藥材，多屬于天然藥物，部分中藥具有抗菌、消炎、滋補、提高免疫力等作用，并且價格低廉，不易產生耐性，毒副作用低，并有研究表明，中藥可以消除耐藥質粒，對細菌耐藥具有逆轉作用，降低細菌的選擇壓力[2-6]。因此，研發中藥作為抗菌藥物的替代藥具有重要的現實意義。

本試驗對13株致犢牛腹瀉的沙門菌對抗菌藥物和中藥的敏感性進行檢測，為臨床治療該病用藥提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥品 中藥：黃連、蒲公英、桔梗、板藍根、石榴皮、知母、紫花地丁、白頭翁、秦皮、烏梅、蘇木、訶子、肉豆蔻、連翹、金銀花、五倍子、女貞子、魚腥草、黃柏、柴胡、五味子、黃芩，均購自秦皇島唐人醫藥藥店。藥敏紙片，購自杭州天和微生物科技股份有限公司。96孔細菌培養板，購自美國Corning公司。2%的氯化三苯四氮唑，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 菌株 河北地區犢牛腹瀉沙門菌地方流行株(NS1～NS13)，由河北預防獸醫重點實驗室提供。

1.3 菌液制備 將凍存的犢牛腹瀉沙門菌接種于LB瓊脂培養基，置于37 ℃恒溫培養箱培養12 h，挑取單菌落接種于LB液體培養基中，置于37 ℃恒溫搖床培養過夜，次日以1∶100的比例轉接，于37 ℃搖床培養至對數期(OD600 nm≈0.6)，調整菌液濃度至1×106CFU/mL后備用。

1.4 沙門菌的抗菌藥物敏感性試驗 采取K-B紙片法，參照美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)藥物敏感性試驗方法檢測13株沙門菌對氨芐西林、頭孢曲松、阿莫西林等15種抗菌藥物敏感性。試驗結果按照CLSI標準進行判定。

1.5 中藥藥液制備 采用傳統的水煎煮法制備中藥藥液。稱量100 g中藥，加入5～10倍量的蒸餾水浸泡1 h，浸泡后大火加熱至煮沸，文火煎煮0.5 h，共煎煮2次。將煎煮的藥液合并，用紗布過濾后離心，濃縮藥液至100 mL即含生藥濃度1 g/mL，高壓后分裝，置于4 ℃冰箱備用。

1.6 中藥的體外抑菌直徑的測定 參考文獻[7-8]，采用瓊脂打孔法測定中藥對13株沙門菌的體外抑菌直徑。每個LB平板加入100 μL 1.3中制備的菌液并涂勻，待平板吸收完全后用直徑為6 mm打孔器打孔，用酒精燈封底，每孔灌滿1.5中制備的中藥提取液(約0.1 mL)，對照孔加入滅菌后的PBS。置于37 ℃恒溫培養箱培養12 h，測量抑菌圈直徑，試驗重復3次，取3次抑菌圈直徑的平均值作為最終結果。判定標準：極敏(抑菌圈直徑≥20 mm),高敏(20 mm>抑菌圈直徑≥15 mm),中敏(15 mm>抑菌圈直徑≥10 mm),低敏或耐藥(抑菌圈直徑<10 mm)。

1.7 中藥的最小抑菌濃度(MIC)測定 參考文獻[7，9]，采用改良微量二倍稀釋平板法測定中藥的MIC。在96孔細菌培養板的第2～11孔加入100 μL滅菌蒸餾水，第2孔加入100 μL 1.5中制備的中藥提取液，混勻后取100 μL倍比稀釋至第9孔后棄100 μL，第2～11孔補加100 μL 2×LB液體培養基，在第2～10孔加入10 μL 1.3中制備的菌液，第10孔為陽性對照組，不加入中藥液，第11孔為陰性對照組，不加入菌液。置于37 ℃恒溫培養箱培養24 h。判定結果時，在培養板中加入5 μL 2%的氯化三苯四氮唑(TTC)，置于37 ℃恒溫培養箱2 h，以不顯紅的最高稀釋孔的中藥濃度為MIC。

1.8 中藥的最小殺菌濃度(MBC)測定 分別取1.7中96孔培養板培養后的液體50 μL，涂布于LB平板上，置于37 ℃恒溫培養箱培養12 h。以無細菌生長的中藥濃度為MBC。

2 結果

2.1 沙門菌的抗菌藥物敏感性試驗 抗菌藥物敏感性試驗結果顯示(表1)，13株分離菌對替米考星、土霉素、磺胺間甲氧嘧啶、復方新諾明高度耐藥，耐藥率高達100%，其他11種抗菌藥耐藥率在30.77%～92.31%。13株沙門菌對阿米卡星的敏感率最高，敏感率為69.23%。13株沙門菌分別對7～15種抗菌藥耐藥，菌株NS8、NS11對試驗的15種抗菌藥全部耐藥(圖1)。試驗結果表明，13株犢牛腹瀉沙門菌具有多重耐藥性，并對檢測15種抗菌藥均表現出不同程度的耐藥。

圖1 13株分離菌對15種抗菌藥的耐藥數Fig.1 The resistance of 13 isolates to 15 antibacterial drugs

表1 13株沙門菌對抗菌藥物敏感性試驗結果Table 1 Antimicrobial susceptibility test results of 13 Salmonella strains

2.2 中藥的體外抑菌直徑測定 試驗結果顯示(圖2)，13株沙門菌對8種中藥表現出不同程度的敏感性，分別為五倍子、五味子、烏梅、訶子、女貞子、石榴皮、蘇木、黃芩。黃連、蒲公英、桔梗、板藍根、知母、紫花地丁、白頭翁、秦皮、肉豆蔻、連翹、金銀花、魚腥草、黃柏、柴胡、五味子15種中藥對試驗的沙門菌表現為無抑菌效果。中藥的體外抑菌直徑測定試驗結果表明，五倍子對13株沙門菌抑菌作用最強，五味子、烏梅、訶子、女貞子、石榴皮、蘇木、黃芩對沙門菌具有一定的抑菌作用，且不同菌株對同種中藥表現出的敏感程度不同。

圖2 13株沙門菌對8味中藥的體外抑菌敏感程度Fig.2 In vitro antimicrobial sensitivity of 13 Salmonella strains to 8 traditional Chinese medicines

2.3 中藥的最小抑菌濃度(MIC)測定 中藥MIC測定結果顯示(表2)，石榴皮對13株沙門菌的MIC為31.25～250.00 mg/mL，石榴皮對13株沙門菌的MIC為7.81～62.50 mg/mL，蘇木對13株沙門菌的MIC為62.50～250.00 mg/mL，訶子對13株沙門菌的MIC為15.63～31.25 mg/mL，五倍子對13株沙門菌的MIC為7.81～31.25 mg/mL，女貞子對13株沙門菌的MIC為31.25～250.00 mg/mL，五味子對13株沙門菌的MIC為7.81～62.50 mg/mL，黃芩對13株沙門菌的MIC為125.00～250.00 mg/mL，其余中藥對試驗的沙門菌均表現無抑菌效果。

2.4 中藥的最小殺菌濃度(MBC)測定 中藥MBC測定結果顯示(表2)，石榴皮對13株沙門菌的MBC為62.50～125.00 mg/mL，烏梅對13株沙門菌的MBC為7.81～62.50 mg/mL，蘇木對13株沙門菌的MBC為125.00～250.00 mg/mL，訶子對13株沙門菌的MBC為15.63～62.50 mg/mL，五倍子對13株沙門菌的MBC為7.81～31.25 mg/mL，女貞子對13株沙門菌的MBC為31.25～250.00 mg/mL，五味子對13株沙門菌的MBC為7.81～31.25 mg/mL，黃芩對13株沙門菌的MBC為125.00～250.00 mg/mL，其余中藥對13株沙門菌表現為無抑菌效果。綜合抑菌直徑測定試驗、MIC和MBC測定試驗，22種單味中藥中只有8種中藥對13株沙門菌具有抑菌效果，抑菌強度從強到弱依次為五倍子、五味子、烏梅、訶子、女貞子、石榴皮、蘇木、黃芩，并且MIC與MBC數值存在一定的差別。

表2 13株沙門菌對8味中藥的MIC和MBC測定結果Table 2 MIC and MBC test results of 8 traditional Chinese medicines by 13 Salmonella strains (mg/mL)

3 討論

沙門菌是人獸共患病菌，對人類與畜禽健康造成嚴重的威脅[10]。在畜牧生產中，沙門菌感染幼齡動物可引起腹瀉、敗血癥等，造成較高的淘汰率；感染成年動物后經常無臨床癥狀，但感染動物長期帶菌，成為感染源，并且該菌可垂直傳播，給畜禽養殖造成嚴重的經濟損失[11-13]。沙門菌的防治依靠抗生素類藥物，但在畜牧養殖過程中，經常會出現抗生素藥物濫用現象，這加速了細菌耐藥性的產生。有研究報道，從犢牛分離的細菌多重耐藥情況十分嚴重[14]。根據當地防治情況，本試驗對從河北地區分離的13株致犢牛腹瀉沙門菌對抗菌藥物和中藥的敏感性進行了研究。

在本試驗中，13株沙門菌均具有多重耐藥性，耐藥數從7～15種不等，且不同菌株之間的耐藥情況不同。檢測的15種抗菌藥中，13株沙門菌對替米考星、土霉素、磺胺間甲氧嘧啶和復方新諾明耐藥率高達100%，表明在河北地區犢牛腹瀉沙門菌對這4種抗菌藥物的耐藥性較高，不推薦臨床繼續使用這4種藥物。13株沙門菌對阿米卡星的敏感率最高，但仍有個別菌株對阿米卡星表現耐藥，臨床應用時應注意合理用藥。據喻華英等[15]報道，其分離出牛腹瀉沙門菌對慶大霉素、卡那霉素、頭孢噻肟敏感度較高，和本試驗中的結果不同，這可能與地區和牛群飼養和治療用藥等方面有關。

致犢牛沙門菌對抗菌藥的耐藥性較高，為解決該問題，中藥作為抗菌藥的替代藥成為熱點研究對象。本試驗采取臨床上較為常用的水煎煮法提取中藥，檢測13株沙門菌對22味中藥提取液的敏感性。22種單味中藥只有8種中藥對13株沙門菌具有抑菌效果，抑菌強度從強到弱依次為五倍子、五味子、烏梅、訶子、女貞子、石榴皮、蘇木、黃芩。據吳美云[16]報道，烏梅、黃芩、黃連和大黃對奶牛腸道沙門菌有抑菌效果，其中烏梅的抑菌效果最佳；呂信[17]報道的“犢泄康”能有效的防治犢牛腹瀉，“犢瀉康”由黃連、黃柏、白頭翁、烏梅、訶子等13味中藥組成。在本試驗中，烏梅、訶子、黃芩、訶子的水煎煮提取液同樣對13株沙門菌具有抑菌效果，但白頭翁、黃連、大黃無抑菌效果，這可能與提取方法、菌株來源不同有關。據李東等[18]報道，五倍子對豬霍亂沙門菌具有良好的抑菌效果；陳虹[19]報道，五倍子對豬傷寒沙門菌和豬霍亂沙門菌具有較好的抑菌效果，在本試驗中，五倍子對犢牛腹瀉沙門菌的抑菌效果同樣最佳，與李東等和陳虹的試驗結果相同，表明五倍子對動物腸道沙門菌具有較好的抑菌效果，可以作為沙門菌病的治療藥物進行研究。

通過對13株犢牛腹瀉沙門菌對抗菌藥以及中藥敏感性研究發現，13株沙門菌對抗菌藥耐藥情況較為嚴重，而部分中藥對沙門菌具有良好的體外抑菌效果，為臨床應用抗菌藥和中藥治療沙門菌所致犢牛腹瀉病提供科學依據。