不同程度冷應激對阿勒泰羔羊及雜交種血清中部分激素與抗氧化能力的影響

高靜雯 ， 高建鵬 ， 汪驍軒 ， 李傲寒 ， 趙 鑫 ， 張 莉 ， 齊亞銀

(1.石河子大學動物科技學院 ， 新疆 石河子 832000 ； 2.寧夏大學農學院 ， 寧夏 銀川 750021)

Correspondingauthors：QI Ya-yin , E-mail ： qiyayin@163.com ； ZHANG Li , E-mail : zhangli@shzu.edu.cn.

我國北部高寒地區的動物，冷刺激是其最為常見的應激源。根據應激時間的長短可將其分為急性冷應激和慢性冷應激，急性冷應激是指短時間內機體處在溫度較低的環境中所產生的反應；動物在冷環境下長期暴露后，應激激素水平和其他生理反應達到適應于低溫的新的平衡狀態，此時通常稱為慢性冷應激或者冷適應(Cold adaptation)[1-3]。有學者認為，根據冷刺激的程度不同，可以將應激劃分為4種類型：良性應激(Eustress)，惡性應激(Distress)，強應激(Hyperstress)和弱應激(Hypostress)[4]。

由于蛋白質含量高，氨基酸平衡，膽固醇低，嫩度良好和多汁性，羊肉在顧客中越來越受歡迎[5]。新疆北部阿勒泰地區冬季嚴寒，在長期的低溫條件下培育出的阿勒泰羊具有良好的抵抗寒冷的能力。薩福克羊是體型最大的肉用羊品種，具有早熟、繁殖率高、適應性強、生長速度快、產肉多、肉質好等特點[6]。目前，如何在寒冷地區具有抗寒能力且能提高羊肉的品質和提供更多的食物更受到關注。阿勒泰羊能耐住冬季的寒冷，但脂肪含量明顯偏多，有報道表明，薩福克羊與阿勒泰羊雜交，其后代(雜交種)的胴體品質得到了明顯改善，符合人們對“低脂肪、高蛋白”的消費需求[7]。已有報道表明，冷應激能夠引起抗氧化指標含量的改變，Selman等研究表明，長期冷暴露可使田鼠骨骼肌、心肌及腎臟的過氧化氫酶(Catalase from bovine liver，CAT)活性和心肌谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)活性代償性升高，而超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性及蛋白含量在任何組織中均未有顯著變化，進而反映出機體代謝率升高[8]； 楊莉等對寒冷應激條件下阿勒泰羊脂肪代謝相關基因的含量進行了研究[9]； 但關于阿勒泰羔羊與雜交種羔羊在冷刺激下的激素含量等相關研究卻報道較少。本試驗檢測不同程度寒冷應激前后阿勒泰羔羊及雜交種羔羊血清中部分激素和抗氧化指標的含量變化，旨在從低溫對不同品種綿羊激素和抗氧化成分的分泌方面分析阿勒泰和雜交種羔羊冷應激的可能適應性機制，為新疆綿羊抗寒育種工作提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品 選擇健康、體重(25±3)kg的4月齡阿勒泰羔羊和阿勒泰(♀)與薩福克(♂)雜交種公羔羊各22只，相同飼喂條件下，半封閉式圈養，進行2個不同程度的冷刺激，隨機分為11組，每組4只。冷應激0 h為常溫對照組(15～20 ℃)，溫度一為弱冷刺激條件(-15～-25 ℃)和溫度二為強冷刺激條件(-30～-35 ℃)，分別經過冷刺激6 h、 1 d、4 d、12 d和24 d飼養(6 h和1 d為急性冷刺激，4、12 d和24 d為慢性冷刺激)，日糧為青貯與苜蓿干草混合料，每日喂料2次，自由飲水。通過頸靜脈采血，采樣前12 h內禁止飼喂，析出血清放入-80 ℃冰箱冷凍備用。

1.2 主要試劑 綿羊胰高血糖素(Glucagon，GC)、胰島素(Insulin，INS)、瘦素(Leptin，LEP)酶聯免疫檢測試劑盒，總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、還原型谷胱甘肽(Glutathione、GSH)、谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase、GR)，均購自南京建成生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 全自動酶標儀(PowerWave XS2)；光明隔水式恒溫培養箱(北京市永光明醫療儀器廠)；全自動高壓蒸汽滅菌罐；超凈工作臺Boxun(上海博迅實業有限公司)；超低溫冰箱；微量移液器(Eppendorf公司)。

1.4 方法

1.4.1 血清中激素和抗氧化物的測定 采用酶聯免疫吸附的方法對血清中GC、INS、LEP進行濃度的測定。T-SOD活力、GSH含量、MDA含量、GR活力，均送南京建成生物科技有限公司檢測。結果中將不同激素的單位都換算成ng/mL，其中1 ng/mL=1 mIU/L /21.2，1 ng/mL=1 000 ng/L。

1.4.2 數據統計與分析 試驗數據使用Excel 2010軟件初步整理，采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，結果均以平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 冷應激前后阿勒泰羔羊與雜交種血清中激素含量變化

2.1.1 不同程度冷刺激下阿勒泰羔羊血清中激素含量變化 結果見表1。阿勒泰羔羊急性冷應激時，溫度一和溫度二條件下各時間段與常溫相比，GC含量均先下降后上升，且6 h時差異極顯著(P<0.01)。溫度一條件下INS含量在急性和慢性冷應激均極顯著下降(P<0.01)；溫度二條件下，急性冷應激時先下降后上升。溫度一條件下LEP含量變化不明顯(P>0.05)；而溫度二條件下，急性冷應激時LEP含量先極顯著下降(P<0.01)后上升，慢性冷應激成波動變化，4 d和24 d都極顯著下降(P<0.01)。

表1 不同程度冷刺激下阿勒泰羔羊血清中GC、INS、LEP含量變化Table 1 Changes of serum GC,INS and LEP contents of Altay lambs under different degrees of cold stimulation

2.1.2 不同程度冷刺激下雜交羔羊血清中激素含量變化 結果見表2。雜交羔羊在溫度一條件下GC含量與常溫組比較，除4 d外均極顯著上升(P<0.01)；在溫度二條件下GC含量較常溫均極顯著升高(P<0.01)。溫度一條件下，急性冷應激時INS含量先極顯著上升后極顯著下降(P<0.01)，慢性冷應激時除12 d極顯著上升外(P<0.01),含量與常溫基本無異；溫度二條件下INS含量則持續上升,且慢性冷應激時變化顯著(P<0.05)。LEP含量溫度一和溫度二時均高于常溫。

表2 不同程度冷刺激下雜交羔羊血清中GC、INS、LEP含量變化Table 2 Changes of serum GC,INS and LEP contents of hybrid lambs under different degrees of cold stimulation

2.1.3 溫度一時冷應激下阿勒泰羔羊及雜交種血清中激素含量變化 如圖1所示，溫度一條件下，阿勒泰羔羊與雜交種羔羊GC含量在常溫、冷刺激6 h及冷刺激12 d時都存在極顯著差異(P<0.01)，且趨勢有明顯區別；2個品種羔羊血清中LEP含量差異較小，除冷刺激4 d時含量差異極顯著外其他時間段無顯著性(P>0.05)；INS含量則與LEP含量相反，除了冷刺激4 d差異無顯著性，其他時間皆有差異顯著性(P<0.05)。

圖1 溫度一條件下阿勒泰羔羊與雜交種羔羊血清中GC、INS、LEP含量變化Fig.1 Changes of serum GC,INS and LEP content in Altay lamb and hybrid lamb under temperature-one conditionA： GC含量變化; B： INS、LEP含量變化A: Content changes of GC; B: Content changes of INS, LEP

2.1.4 溫度二時冷應激下阿勒泰羔羊及雜交種血清中激素含量變化 如圖2所示，溫度二條件下，阿勒泰羔羊與雜交種羔羊相比，GC含量在冷刺激6 h時差異顯著(P<0.05)，12 d時則差異極顯著(P<0.01)，其他時間段含量差異不顯著(P>0.05)；阿勒泰羔羊及雜交種羔羊的LEP含量變化幅度不是很大，但2個品種之間除冷刺激4 d和24 d外，均存在差異顯著性；LEP含量在慢性冷刺激時2個品種間含量則都差異極顯著(P<0.01)。

圖2 溫度二條件下阿勒泰羔羊與雜交種羔羊血清中GC、INS、LEP含量變化Fig.2 Changes of serum GC,INS and LEP content in Altay lamb and hybrid lamb under temperature-two conditionA： GC含量變化; B： INS、LEP含量變化A: Content changes of GC; B: Content changes of INS， LEP

2.2 血清中抗氧化指標的變化 如圖3A所示，冷刺激6 h時SOD活力相較于常溫為上升狀態，1 d時則下降；而SOD活力在冷刺激4 d時上升、12 d時下降、24 d時又有所上升；在溫度一只有1 d和4 d時阿勒泰羔羊SOD活力高于雜交種羔羊，其他時間段阿勒泰羔羊的SOD活力都低于雜交種羔羊，而在溫度二時阿勒泰羔羊SOD活力總體都要比雜交種羔羊活力略高。如圖3B所示，溫度一條件下，在6 h時MDA含量升高，1 d時MDA含量降低，而4 d到24 d繼續呈略微的下降趨勢；溫度二條件下，MDA含量呈持續下降趨勢。如圖3C所示，GSH活力總體呈下降趨勢；溫度一條件下，4 d時阿勒泰羔羊和雜交種羔羊的GSH活力都降到最低，24 d 時下降，溫度二條件下，6 h時急劇下降，后期GSH活力緩慢下降。如圖3D所示，雜交種羔羊GR含量持續下降，24 d時快速上升；阿勒泰羔羊GR含量則在6 h時急劇上升，后含量不斷下降至冷刺激12 d達到最低值，在24 d時快速上升。

圖3 不同冷刺激條件下羔羊血清中抗氧化指標含量變化Fig.3 Changes of antioxidant index content in lamb serum under different cold stimulation conditionsA:SOD活力變化; B:MDA含量變化; C:GSH活力變化; D:GR含量變化A: Activing changes of SOD; B: Content changes of MDA; C: Activity changes of GSH; D: Content changes of GR

3 討論

3.1 不同程度冷刺激激素含量的變化 胰島素(INS)和胰高血糖素(GC)是近年來被關注較多的神經內分泌因子。穆淑琴等[10]對育肥豬季節性冷刺激研究發現，短期冷刺激可以降低血液中胰島素水平，增加血糖濃度；Xu等[11]研究結果也表明，10 ℃ 的冷水刺激可使人血清中胰島素降低；劉璐[12]的研究結果也發現，冷暴露后15～120 min羔羊血漿中血糖濃度顯著高于同一時間點對照羔羊的血糖；王金濤[13]對冷應激后的雛雞研究發現急性冷應激下INS的濃度先升高后降低，隨后又顯著升高，以上研究結果與本試驗結果相似。

本試驗結果表明，阿勒泰羔羊在急性冷應激時，INS的含量均較常溫有所下降，GC的含量都是先極顯著降低后升高；慢性冷應激時，INS含量在2個強度冷刺激下都極顯著下降，GC含量在弱冷刺激時低于常溫，在強冷刺激時高于常溫。說明急性冷刺激時，刺激了腎上腺，導致血糖不平衡，使得糖原分解和糖異生加強，機體代謝率增加，慢性冷刺激時，冷刺激強度越高則羔羊的代謝率越強，同時INS與GC之間也進行相互的刺激，機體的其他功能也被迫加速啟動，甚至動用脂肪沉積的能量，分解體內的營養物質，產生大量葡萄糖，從而使血糖含量增加，也能從側面說明阿勒泰羔羊即使在強度冷應激下也能很快適應產生大量能量，從而提高機體對寒冷及饑餓的能力。

雜交種羔羊冷刺激后GC含量皆高于常溫，弱冷刺激時呈下降趨勢，強冷刺激時呈上升趨勢，可能是因為雜交種羔羊不能較快的適應冷暴露，在突然遭到寒冷應激時為維持體溫及內環境的穩定，羔羊短期內主要消耗糖分解產生的能量，因而血清中血糖含量稍有下降；冷刺激后INS含量均高于常溫含量，急性冷刺激后2個強度下均是先上升后下降，慢性冷刺激后低強度下先上升后下降。由結果猜測，雜交種羔羊可能遺傳了阿勒泰羊的耐高寒能力，并且在冷應激強度較大時可能抗寒能力甚至強于純種阿勒泰羔羊。

瘦素(LEP)是由肥胖基因編碼、脂肪細胞分泌的一種激素，主要通過抑制食欲減少能量攝取、增加能量消耗和抑制脂肪合成，促進脂肪分解3種機制調節機體脂肪沉積[14]。本試驗中弱冷應激后阿勒泰羔羊血清中LEP有較小變化，強冷應激后急性和慢性冷應激時LEP都是先極顯著下降后上升。雜交種羔羊冷應激后LEP含量均高于常溫的含量。

3.2 冷應激對阿勒泰及雜交種羔羊血清抗氧化性能的影響 動物在適應的環境溫度內，一些與免疫相關的抗氧化物等物質維持著促氧化和抗氧化間的平衡，應激則會改變這種平衡，降低動物免疫力[15]。抗氧化防御系統是動物機體在進化中形成的一個完整而復雜的防御系統，正常動物體內存在具有保護性抗氧化反應物質，以維持細胞不受自由基損害而發生病理變化[16]。SOD的主要作用就是降解清除體內的活性氧自由基，因此檢測SOD的活性可以反映清除自由基的能力及抗氧化能力[17]。MDA是自由基作用于脂質發生過氧化反應的最終產物之一[15]。

有研究表明，冷應激可以改變生物體的促氧化與抗氧化間的平衡[18]。大鼠在冷應激條件下，可引起血清中SOD活性降低和MDA含量升高[19]；慢性冷應激可使試驗鼠機體內紅細胞的CuZn-SOD活性下降，CAT與GSH-Px活性升高[18]；雛雞在急性應激時，隨應激時間的延長,血清T-AOC逐漸降低,GSH-Px活性、CAT活性、SOD活性及MDA含量均逐漸升高;慢性應激時，隨應激時間的延長,血清T-AOC、GSH-Px活性、CAT活性及MDA含量均逐漸升高，SOD活性逐漸降低[13]；張燕等[20]研究冷應激對荷斯坦奶牛和三河牛的影響發現，血清T-SOD和CuZn-SOD的活力顯著降低，MDA含量顯著增多。

本試驗顯示，急性和慢性冷應激時SOD、MDA、GSH、GR的含量都有很明顯的變化。表明急性和慢性冷應激都對羔羊血液造成氧化損傷，抗氧化能力都有所降低，從而影響動物的健康，是造成畜牧業經濟損失的潛在威脅，本試驗與國內外部分研究并不完全相同，可能由于動物品種、地域、飼養條件等因素差異造成，具體原因有待更有針對性的研究。

4 結論

本試驗選用新疆耐寒品種阿勒泰羔羊和阿勒泰與肉品質良好的薩福克羊雜交的羔羊作為試驗對象，檢測了不同程度低溫條件下，綿羊機體內激素和抗氧化因子參與能量代謝和氧化代謝的變化過程，比較其含量在不同品種之間的變化趨勢和變化差異，揭示了阿勒泰羔羊和雜交種羔羊耐寒的可能適應機制，為新疆綿羊抗寒育種工作提供理論依據。