傳染性支氣管炎病毒nsp4和nsp15通過調節NF-κB和IRF3信號通路抑制I型干擾素表達

徐 剛 ， 馬淑慧

(天津農學院動物科學與動物醫學學院 天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室 ， 天津 西青 300392)

傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis，IB)是由傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起雞的一種急性、高度接觸性傳染病，目前已流行于全球各地，是危害世界各國家禽養殖業發展的重要動物疫病[1-2]。IBV屬于γ冠狀病毒屬，基因組主要編碼4種主要的結構蛋白、4種輔助蛋白以及至少15種非結構蛋白[3-4]。冠狀病毒的多種蛋白成分可參與病毒的感染、復制和抵抗機體的抗病毒反應，其中α冠狀病毒和β冠狀病毒都可以有效地拮抗I型干擾素(Interferon，IFN)的產生[5]。I型干擾素反應是機體先天免疫應答的重要組成部分，主要針對并抵抗病毒的入侵，具有很高的抗病毒活性和廣泛的免疫調節作用[6-7]。而對于γ冠狀病毒屬的IBV來說，病毒與宿主I型干擾素反應的相關性目前研究甚少。

本試驗首先通過IBV感染原代雞胚腎細胞并利用雙鏈RNA類似物poly(I∶C)進行刺激，確定IBV對I型干擾素的抑制作用，然后通過構建IBV的各非結構蛋白真核表達載體，利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)，在DF-1細胞上篩選拮抗I型干擾素的IBV非結構蛋白，并研究其在抑制干擾素生成相關通路中的作用機理，為深入探索IBV的致病機理以及免疫機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 IBV毒株與雞胚 IBV JS株由本實驗室分離，經純化后獲得全基因組序列。SPF雞胚，購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司。

1.2 主要試劑、質粒和細胞 DMEM培養基、胎牛血清(Gibco，美國)；Lipofectamine 2000(Thermo，美國)；總RNA提取試劑盒(TP-01111，福際，成都)；熒光定量反轉錄試劑、熒光定量染料(TaKaRa，日本)；poly(I∶C)(Invivogen，法國)。真核表達質粒pCMV-Myc和雞胚成纖維細胞(DF-1)由本實驗室保存。

1.3 引物設計 根據IBV JS株全基因組序列，通過序列分析和比對，確定非結構蛋白nsp2～nsp16的具體位置，設計用于擴增nsp2～nsp16(不含nsp11/12)基因的特異性引物。參考GenBank數據庫，設計雞IFN-α、IFN-β、NF-κB、IRF3以及GAPDH基因的引物。

1.4 原代雞胚腎細胞(CEK)的制備 取18～20日齡SPF雞胚，無菌從胚中取出胚體后，摘取腎臟，剪碎后在37 ℃下胰酶消化30 min，經200/400目篩網過濾后計數，以4×105個細胞/cm2的量接種于細胞板備用。

1.5 病毒的細胞接種試驗 制備CEK細胞接種于24孔板中，待細胞長至70%～90%，將IBV JS株病毒液以MOI=0.01的劑量接種CEK細胞，37 ℃培養箱培養24 h后添加poly(I∶C)(10 μg/mL)，繼續培養8 h，進行qRT-PCR試驗檢測IFN-α和IFN-β的表達，以GAPDH基因作為內參基因。

1.6 IBV非結構蛋白真核表達質粒的構建 取無菌收集的IBV JS株尿囊液，提取病毒基因組RNA并反轉錄獲得cDNA。利用設計的引物，擴增IBV JS株的非結構蛋白基因片段，連接于pCMV-Myc載體，測序鑒定并保存序列正確的重組質粒。

1.7 IBV非結構蛋白對I型干擾素表達的影響 DF-1細胞接種于24孔板中，待細胞長至70%～90%，以每孔500 ng劑量轉染IBV JS株各非結構蛋白重組質粒，轉染后24 h，以500 ng/mL的劑量轉染poly(I∶C)，16 h后進行qRT-PCR試驗檢測IFN-β基因的表達，以GAPDH基因作為內參基因。

1.8 IBV nsp4和nsp15對NF-κB和IRF3表達的影響 DF-1細胞接種于24孔板中，待細胞長至70%～90%，梯度轉染IBV JS株nsp4和nsp15重組質粒，轉染劑量為50、250 ng和500 ng，以500 ng/mL的劑量轉染poly(I∶C)，16 h后進行qRT-PCR試驗檢測IFN-β、NF-κB和IRF3基因的表達，以GAPDH基因作為內參基因。

1.9 數據統計分析 試驗數據使用GraphPad V8.1.0軟件進行統計學分析，數據之間分析采用單因素方差分析，統計結果表示為：P<0.05(*)時有統計學差異，P<0.01(**)時差異顯著，P<0.001(***)時差異極顯著。

2 結果

2.1 IBV對poly(I∶C)誘導的I型干擾素表達的影響 由圖1可知，單獨添加poly(I∶C)，可誘導細胞產生較高水平的I型干擾素，而IBV感染CEK細胞后產生的I型干擾素量較低。與單獨添加poly(I∶C)組相比，IBV感染后再添加poly(I∶C)，IFN-α和IFN-β的表達量分別降低63%(圖1A)和61%(圖1B)，表明IBV感染可以拮抗I型干擾素的產生。

圖1 IBV對I型干擾素表達的影響Fig.1 Effect of IBV on the expression of type I interferonA：IFN-α基因相對表達量； B：IFN-β基因相對表達量； *：P<0.05A：Relative expression of IFN-α gene； B：Relative expression of IFN-β gene； *：P<0.05

2.2 IBV非結構蛋白對I型干擾素表達的影響 由圖2可知，與空載體轉染組相比，轉染IBV nsp3、nsp 4、nsp7、nsp14和nsp15重組質粒的細胞產生的IFN-β的量分別降低了58.5%、65.1%、60.7%、63.1%和55.7%，其他非結構蛋白重組質粒轉染組未見統計學差異(P>0.05)。

圖2 IBV非結構蛋白對poly(I∶C)誘導的IFN-β mRNA表達的抑制作用Fig.2 Inhibition of poly(I∶C)-induced expression of IFN-β mRNA by IBV nonstructural proteinsVector：空載體轉染組； ***：P<0.001Vector：Cells were transfected with empty vector； ***：P<0.001

2.3 IBV nsp 4和nsp15對NF-κB和IRF3表達的影響 為了探究非結構蛋白在IBV抑制I型IFN表達過程中的作用機理，選取了抑制作用最強的nsp 4以及目前研究較少的nsp15進行進一步試驗。首先將nsp 4和nsp15進行了梯度濃度轉染，檢測這2個蛋白對IFN的抑制作用是否具有劑量依賴性，結果由圖3可見，與空載體轉染組相比，隨轉染量增加，nsp 4轉染組細胞IFN-β的表達量分別降低了9%、20.2%和60.2%(圖3A)，nsp15轉染組細胞IFN-β的表達量分別降低了12.9%、39.9%和51.5%(圖3B)。2種非結構蛋白對IFN的抑制作用均具有劑量依賴性。

圖3 IBV nsp 4和nsp15對poly(I∶C)誘導的IFN-β mRNA表達的抑制作用Fig.3 Inhibition of poly(I∶C)-induced expression of IFN-β mRNA by IBV nsp 4 and nsp15A：nsp4轉染組；B：nsp15轉染組； Vector：空載體轉染組； *：P<0.05； **：P<0.01； ***：P<0.001A：Cells were transfected with nsp4； B：Cells were transfected with nsp15； Vector：Cells were transfected with empty vector； *：P<0.05； **：P<0.01； ***：P<0.001

本試驗還檢測了不同濃度轉染組細胞中NF-κB和IRF3基因的表達情況，結果由圖4可知，與空載體轉染組相比，隨轉染量增加，nsp 4轉染組細胞NF-κB的表達量分別降低了13.8%、32.5%和41%(圖4A)，IRF3的表達量分別降低了6%、19.3%和24.7%(圖4B)；nsp15轉染組細胞NF-κB的表達量分別降低了11.3%、22.4%和25%(圖4C)，而IRF3表達量的變化無統計學差異(圖4D)。

圖4 IBV nsp 4和nsp15對NF-κB和IRF3 mRNA的影響Fig.4 Effect of nsp 4 and nsp15 on the expression of NF-κB and IRF3 mRNA A、C：NF-κB基因相對表達量； B、D：IRF3基因相對表達量； Vector：空載體轉染組；*：P<0.05； **：P<0.01； ***：P<0.001； ns：無統計學差異A，C：Relative expression of NF-κB gene； B，D：Relative expression of IRF3 gene； Vector：Cells were transfected with empty vector；*：P<0.05； **：P<0.01； ***：P<0.001； ns：No statistical differences

3 討論

先天免疫反應是機體抵抗病毒感染的第一道防線，而I型干擾素(IFN-α和IFN-β)是其最重要的細胞因子之一[8-9]。許多冠狀病毒進化過程中形成了一系列的機制來抑制或拮抗機體干擾素抗病毒免疫反應，SARS冠狀病毒(SARS-CoV)和人類冠狀病毒NL63(HCoV-NL63)等在感染過程中不能誘導IFN-β的表達，豬流行性腹瀉病毒(PEDV)可通過抑制IRF3的活性來調控IFN-β的表達，小鼠肝炎病毒(MHV)只能在特定的細胞中激活IFN-β的表達[10-13]。此外，IBV感染的細胞中IFN轉錄水平滯后于病毒基因組的累積，形成的雙層囊泡結構可以有效阻斷感染細胞中干擾素的產生[14-15]。本試驗利用IBV流行株感染CEK細胞，通過添加poly(I∶C)并進行qRT-PCR檢測，證明了IBV可以有效的抑制由雙鏈RNA誘導的I型IFN在CEK細胞中的表達。

冠狀病毒可通過編碼某種蛋白抑制或拮抗宿主的抗病毒先天免疫反應。有研究表明，SARS-CoV編碼的nsp1、nsp3、nsp7、nsp15、S、M、N、3a、3b等都具有拮抗干擾素活性的功能[16-20]；MHV編碼的nsp1、nsp2、nsp3、5a蛋白以及N蛋白等，均可通過不同方式，抑制宿主干擾素的表達[21-22]；體外表達PEDV編碼的23個蛋白中有10個具有抑制干擾素表達的活性，其中包括nsp1、nsp3、nsp7、nsp14、nsp15、E、M、N和ORF3[23-24]。對于IBV來說，輔助蛋白3a和5b通過抑制IFN-β介導的抗病毒通路的激活，或誘導宿主蛋白翻譯的關閉來抑制I型IFN的產生，從而抵抗機體抗病毒反應[15,25-26]。由此可見，冠狀病毒拮抗IFN表達的蛋白絕大多數集中于非結構蛋白，其次是輔助蛋白和結構蛋白，而針對IBV的機理研究，目前沒有確定是何種非結構蛋白在此過程中發揮關鍵作用，而且目前的研究多基于天然無毒力的Beaudette株或是疫苗株M41株，細胞多使用非雞源的細胞系，不能很好的反應流行株對于天然宿主的抗病毒先天免疫情況。本試驗通過構建IBV流行株的非結構蛋白真核表達載體，轉染雞源DF-1細胞，同時轉染雙鏈RNA類似物poly(I∶C)進行刺激，檢測非結構蛋白對I型IFN表達的影響。結果顯示，IBV JS株的nsp3、nsp4、nsp7、nsp14和nsp15均可顯著抑制IFN-β的表達水平，其中nsp7、nsp14和nsp15與前人的結果一致，而nsp4對于IFN-β表達的抑制作用可能是IBV特有的。本試驗篩選了nsp4和nsp15進行濃度梯度的質粒轉染試驗，結果驗證了這2種蛋白對I型IFN的抑制作用呈劑量依賴性。

先天性免疫反應是一系列的信號級聯反應，由模式識別受體(RIG-I或MDA5等)通過識別并結合進入細胞的病毒以及其復制產物來啟動，激活下游IRF3信號通路或并行的NF-κB通路，從而誘導I型IFN的轉錄及表達[27-29]。許多冠狀病毒編碼的蛋白會以IRF3或NF-κB為靶點來逃避先天性免疫反應。PEDV的E蛋白和N蛋白可誘導內質網應激，可以導致NF-κB信號通路的激活；MERS-CoV以及蝙蝠冠狀病毒編碼的輔助蛋白4a，可以阻斷NF-κB信號通路而抑制I型IFN的產生；SARS-CoV的nsp1可以阻斷NF-κB、IRF3和IRF7的激活，并通過阻止STAT1的磷酸化抑制IFN依賴的信號通路的活化，SARS-CoV的木瓜樣蛋白酶(PLP)可以通過調節NF-κB抑制劑IκBα，從而阻斷NF-κB信號通路[21,24-25]。為了探究nsp4和nsp15抑制I型IFN的作用機理，本試驗分別檢測了2種蛋白對NF-κB和IRF3基因轉錄的影響，結果表明，nsp4蛋白可顯著的抑制NF-κB和IRF3的表達，且呈劑量依賴性；而nsp15蛋白只能顯著抑制NF-κB的表達，呈劑量依賴性，但對IRF3的表達無影響。上述內容說明，IBV nsp4蛋白可能是通過同時影響NF-κB信號通路以及IRF3信號通路來拮抗下游IFN-β的表達，而nsp15蛋白對IFN-β表達的抑制作用可能是通過阻斷NF-κB而不是IRF3來實現的。這2種蛋白是如何影響NF-κB或IRF3的表達，仍需繼續研究其上游蛋白的影響來進一步確認。