分子標記鑒定EMS 誘變高粱突變體的真偽

王春語 李政君 陳冰嬬 張麗霞

(1.遼寧省農業科學院高粱研究所,遼寧 沈陽 110161;2.遼寧省農業科學院農作物海南育種中心,海南樂東 572541;3.吉林省農業科學院作物資源研究所,吉林 公主嶺 136100)

隨著誘變育種技術的不斷發展,誘變育種在高粱中逐漸興起[1]。早在1970 年就利用X-射線、γ-射線、EMS(Ethylmethylsulfone,甲基磺酸乙酯)、MMS(Methyl Methanesulfonate,甲基磺酸甲酯)、DES(Diethyl sulfate,硫酸二乙酯)和NEU(N-Ethyl-N-nitrosourea,N-乙基-N-亞硝基脲) 誘變3 個栽培高粱品種,對其誘變率進行了比較研究,結果表明EMS 是最有效的誘變劑[2]。近幾年,EMS 也在高粱誘變育種中得到廣泛應用,分別以粒用高粱BTx623、恢復系晉粱 5 號和保持系V4B 等為實驗材料,成功獲得了葉色、矮化、葉形、分蘗、穗型、成熟期、早衰等不同的突變體[3,4]。另外,從1 600 個單株的高粱EMS 誘變群體中篩選出768 個突變體,并利用Tilling 技術在該突變體庫中篩選出了編碼咖啡酸甲基轉移酶基因的2 個突變體[5]。

EMS 誘變處理隨著處理時間的延長和處理濃度的增加,高粱種子發芽率和成苗率逐漸降低,即使正常出苗對后期營養生長和生殖生長都會產生很大的影響,如植株矮化、葉片皺縮、花期延遲和育性降低等[3～4,6,7]。EMS 處理后,M0代植株單穗結實率是非常重要的指標之一,結實率過高增加篩選壓力且影響誘變效率;結實率過低種子數量過少而造成后代篩選鑒定的困擾,限制了突變體的數量。M0代誘變處理種子由于數量大通常采用開放授粉的方式進行加代繁種,容易接受周圍其它高粱材料花粉而雜交出現假突變體的可能,因此,有必要開發一套實用的分子標記鑒定EMS 誘變突變體的真偽。

本研究基于26 份高粱材料的重測序數據,開發了大量≥3 bp 重復的SSR 分子標記。通過對分子標記有效性和豐度檢測,選擇PCR 擴增目標條帶較單一、多態性豐富的30 個標記用于EMS誘變突變體真偽的鑒定。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

5 個RIL 群體株系分別為:10S008、10S242、9G008、9G015 和4WY006,其中10S008 和10S242均為BTx623 和Rio 雜交構建RIL 群體的2 個株系;9G008 和9G015 均為BTx623 和L316(中國農家種)雜交構建RIL 群體的2 個株系;4WY006 為BTx623 和13-9(高粱微核心種質)雜交構建RIL群體的1 個株系。5 個已知突變體(5M192、4A550、A129、A108 和ZY1)均為BTx623 經EMS誘變獲得的突變體,5M192 和4A550 為蠟層缺失突變體,A129 和A108 為葉色突變體,ZY1 為葉型突變體,均為實驗室已經定位或者克隆基因的突變體。5 個新篩選突變株3T133、4A317、2E52、4A478 和4A211 均為2019 年篩選獲得的與親本BTx623 存在表型差異的EMS 誘變株系。

30 份高粱微核心種質來自國際半干旱研究所,其中包括世界不同地區的農家種和栽培種。

粒用高粱BTx623,遼糯3 由遼寧省農業科學院高粱研究所提供。

以上實驗材料均由遼寧省農業科學院高粱研究所分子改良實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 SSR 分子標記開發

為了開發更多有效的高粱SSR 分子標記,本課題組對14 份不育系和12 份恢復系高粱材料進行10×重測序后開發SSR 分子標記[8]。開發SSR分子標記的標準為:2 bp 重復次數≥6 次、3 bp 重復次數≥5 次、4 bp 重復次數≥4 次、5 bp 重復次數≥3 次以及6 bp 重復次數≥3 次,重測序、數據分析及SSR 分子標記開發均由北京普朗泰科生物科技有限公司完成。

1.2.2 PCR 擴增體系及程序

PCR 反應體系總體積為20 μl,包括2×EasyTaq?PCR SuperMix (+dye) 10 μl,正向引物F 0.3 μl,反向引物R 0.3 μl,DNA 1 μl (≤100 ng)和ddH2O 8.4 μl。PCR 反應程序:95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s(35 cycles),72 ℃ 10 min。2×EasyTaq?PCR SuperMix (+dye)(貨號:AS111-11)購買于北京全式金生物技術有限公司,引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

玻璃板用酒精擦洗干凈,并用密封膠條、夾子和墊片將玻璃板固定好。將8 ml 30%丙烯酰胺預制膠(上海迪申生物技術有限公司,貨號:B1610156)、4 ml 5×TBE 溶液、27.5 ml 蒸餾水、450 μl 10%過硫酸銨和50 μl TEMED(四甲基乙二胺)充分混均迅速灌入裝好的玻璃板中,插上梳子,室溫放置15 min 以上,配置成6%聚丙烯酰胺凝膠。將制備好的膠板放置于已經加入1×TBE 緩沖液的垂直電泳槽中,每個PCR 擴增樣品上樣1.5 μl,130 V、電泳40 min～1 h 后關閉電源。取膠,放入硝酸銀染色液(0.5 g AgNO3充分溶于500 ml 蒸餾水)染色15 min,用蒸餾水沖洗染色后的膠3 次,然后放入顯影液(10 g NaOH、0.2 g 碳酸氫鈉充分溶于500 ml 蒸餾水中,再加入5 ml 甲醛混均,現用現配),輕搖至膠顯出清晰的條帶為止。照相,存儲,記錄、分析數據。

2 結果與分析

2.1 SSR 分子標記開發

基于26 份高粱材料的重測序數據以及SSR分子標記開發標準,共開發了24 441 個SSR 標記,其中2 bp 重復共有11 051 個,≥3 bp 重復的共有13 390 個(圖1)。

為了便于聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測以及分析,選擇≥3 bp 重復的SSR 多態標記用于本研究。分別選擇100 個位于基因上和100 個位于非基因上的SSR 標記,以BTx623 和雜交種遼糯3為材料檢測標記的有效性。其中,位于基因上的7 個標記以及位于非基因上的4 個標記在兩份材料中無擴增條帶,判定為無效標記(圖2)。

因此,基因上和非基因上共有189 個SSR 分子標記PCR 可以有效擴增目標條帶,分子標記開發成功率達到94.5%。

2.2 SSR 分子標記鑒定

為了檢測SSR 分子標記的豐度,隨機選擇30份高粱微核心種質材料檢測189 個標記在自然群體材料中的多態性。選擇多態性≥2 的標記作為檢測備用標記,符合此標準的基因上共有19 個標記,非基因上共有51 個標記(圖3)。

為了提高標記鑒別能力以及實用性,從70 個標記中選擇PCR 擴增目標條帶較單一、多態性差異大、且便于聚丙烯酰胺凝膠電泳分析的30 個標記用于EMS 突變體真偽鑒定。30 個標記每條染色體平均分布3 個,其中3 個標記位于基因上,27個標記位于非基因上(表1)。

以基因上標記Chr8-3 為例,該標記在30 份自然群體材料中共有3 種多態類型,分別為I 型、II 型和III 型(圖4);而非基因上標記Chr1-12 在30 份自然群體材料中共有8 種多態類型,分別為I 型、II 型、III 型、IV 型、V 型、VI 型、VII 型和VIII型(圖5)。

2.3 SSR 分子標記驗證

EMS 誘變后代通常采用開放授粉,易接受其它高粱材料花粉后雜交產生假突變體的可能性。選擇5 個其他高粱材料和BTx623 雜交后獲得的RIL 群體株系以及5 個BTx623 經EMS 誘變后獲得的已知突變體驗證30 個標記的有效性及鑒別能力。5 個不同RIL 群體株系與親本BTx623 相比,PCR 擴增目標條帶差異很大。10S008、10S242、9G008、9G015、4WY006 與BTx623 相比,30 個標記中存在差異的標記分別為10、11、12、10和9 個(圖6)。而BTx623 經EMS 誘變后5 個已知突變體 A129、ZY1、A108、5M192、4A550 與BTx623 相比,30 個標記PCR 擴增條帶無差異(圖7)。

由此可見,本研究開發、篩選的30 個標記可以用于突變體真偽的鑒定。

2.4 EMS 誘變突變體鑒定

利用上述30 個SSR 分子標記鑒定2019 年新篩選到的有明顯表型差異的株系是否為BTx623經EMS 誘變后獲得的突變體。

3T133、4A317 和2E52 經PCR 擴增后,電泳結果顯示30 個標記目標條帶大小與親本一致,為BTx623 經EMS 誘變后獲得的突變體(圖7)。4A478 和4A211 經PCR 擴增后,分別有6 個和5個標記PCR 擴增條帶大小和BTx623 存在差異。經過田間表型調查,BTx623 葉主脈為蠟脈且無芒,而4A478 和4A211 為白脈、且存在無芒、有芒植株分離,因此,判定4A478 和4A211 為假突變體(圖8)。

圖1 SSR 分子標記種類及數量Figure 1 Types and numbers of SSR molecular markers

圖2 基因上和非基因上200 個SSR 分子標記有效性檢測Figure 2 Effectiveness detection of 200 SSR molecular markers on genes and non-genes

圖4 基因上Chr8-3 標記多態性檢測Figure 4 Polymorphism detection of Chr8-3 marker on gene

圖5 非基因上Chr1-12 標記多態性檢測Figure 5 Polymorphism detection of Chr1-12 marker on non-gene

圖6 6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測BTx623 與5 個RIL 群體株系30 個SSR 分子標記的差異Figure 6 Differences of 30 SSR markers between BTx623 and 5 RIL lines detecting by 6% polyacrylamide gel electrophoresis

圖7 6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測BTx623 與5 個已知EMS 突變體30 個SSR 分子標記的差異Figure 7 Differences of 30 SSR markers between BTx623 and 5 known EMS mutants detecting by 6% polyacrylamide gel electrophoresis

圖8 6%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測BTx623 與5 個新篩選EMS 突變體30 個SSR 分子標記的差異Figure 8 Differences of 30 SSR markers between BTx623 and 5 newly screened EMS mutants detecting by 6% polyacrylamide gel electrophoresis

3 結論與討論

EMS 誘變劑處理濃度和處理時間對M0代種子的萌發率、出苗率、植株長勢以及結實率都有較大的影響。高粱材料不同,EMS 處理時間和濃度也不同[3,7]。綜合考慮M0代處理種子的出苗率、結實率和突變效率,對于粒用高粱BTx623 采用0.2% EMS 處理20 h 后,結實率為15.3%[3]。隨著EMS 處理濃度和處理時間的增加,M0代植株的結實率顯著較低,其中對花粉活力的傷害更大,柱頭更容易接受外來花粉。為了保證誘變后種子的純度,我們嘗試M0代植株全部套袋自交,結果導致結實率更低、甚至不結實(數據未發表)。為了保證M0代植株正常結實通常種植于隔離區開放授粉,但是由于M0代植株花粉活力受損以及高粱是常異花授粉作物,即使這樣仍然存在和其他高粱材料雜交的可能。當篩選到差異表型植株時,有必要鑒定這些植株是來自雜交還是誘變。

兩個不同高粱材料雜交,由于染色體大片段交換,即使多代自交成為RIL 群體株系,與親本相比,分子標記檢測后不同株系之間差異很大。如10S008 和10S242 是BTx623 與Rio 雜交獲得的2個RIL 群體株系,與親本BTx623 相比,30 個分子標記中存在差異的標記分別為10 個和11 個(圖6)。然而BTx623 經EMS 誘變獲得的突變體則不同,30 個標記在不同突變體中PCR 擴增條帶均與親本一致(圖7、圖8)。

選擇PCR 擴增條帶單一、多態性豐富、且不同材料間片段差異大的分子標記更利于聚丙烯酰胺凝膠電泳結果分析、統計。由于基因在不同材料間的保守性,開發分子標記數量有限。基于26份高粱材料的重測序數據共開發了24 441 個≥2 bp 重復的SSR 分子標記,其中位于單拷貝基因(含編碼區、UTR區、內含子區和啟動子上下游2 kb)內共有6 733 個[8]。本研究篩選到的30 個SSR 分子標記,3 個標記位于基因上,27 個位于非基因上(表1)。位于基因上的標記往往多態性差、鑒別能力低,但是PCR 擴增目標條帶較為單一利于分析(圖4)。然而位于非基因上的標記,PCR 擴增非目標條帶較多,但是多態性豐富,鑒別能力強(圖5)。

EMS 誘變通常產生單堿基突變[9,10],但是也會造成單堿基、多堿基缺失,堿基缺失的概率一般不會超過高粱基因組大小的2%(數據未發表)。因此,適宜用SSR 分子標記的方法鑒定EMS 誘變突變體的真偽。利用30 個標記檢測,如果是雜交后產生的假突變體,與親本存在差異的標記數目通常較多(圖6)。倘若與親本相比,只有1 個標記存在差異,該突變體的真假還需要進一步驗證。

本研究基于26 份高粱材料的重測序數據,經過對分子標記有效性以及多態性鑒定,篩選到≥3 bp 重復的30 個SSR 分子標記用于EMS 突變體真偽鑒定。