紫前款甘散的質量標準研究

康誦垚 ， 楊 釗 ， 王春元 ， 楊芬芳 ， 郝智慧

(1.青島農業大學病原微生物與新藥創制實驗室 ， 山東 青島 266000 ； 2.青島市食品藥品檢驗研究院 ， 山東 青島 266071 ； 3.中國農業大學中獸醫藥創新中心 ， 北京 海淀 100193)

紫前款甘散是根據臨床驗方開發研制而成的一種中藥復方散劑，本方以紫菀、前胡、款冬花、甘草、枇杷葉、白前共 6 味藥材為原料，經粉碎、過篩、混勻、包裝等而成的散劑，具有潤肺下氣、止咳化痰之功效[1-3]。該臨床驗方有一定的臨床療效，擬開發成國家新獸藥，但尚無統一的行業或國家質量標準?，F行的中藥散劑標準多從性狀、鑒別、檢查、浸出物等方面對中藥散劑的質量進行控制，較少有涉及含量測定的內容[4]。因此，建立紫前款甘散簡便可行的定性、定量檢測方法，對制劑的質量進行全方位的控制顯得尤為重要?；诖?，本試驗采用顯微鑒別方法，對處方中的紫菀、前胡、甘草、款冬花、枇杷葉進行鑒別 ； 采用薄層色譜法(Thin layer chromatography, TLC)對處方中前胡、甘草、枇杷葉進行鑒別 ； 應用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)對該處方的特征成分紫菀酮進行定量分析，旨在為其質量控制及質量標準的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗藥品與試劑 紫前款甘散，規格：500 g/袋，批號:2018061201、2018061202、2018061203。對照藥材：前胡，批號：120951-201706，枇杷葉，批號：121261-201303，甘草，批號：120904-201519。對照品：白花前胡甲素，批號：111711-201703，含量以 98.8%計；白花前胡乙素，批號：111904-201203，含量以 98.0%計；熊果酸，批號：110742-201823，含量以 94.7%計，紫菀酮，批號：111581-201605；含量以 99.8%計，均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 主要儀器 BX-53 型顯微鏡(奧林巴斯);Agilent 1200 型高效液相色譜儀；AL204 型電子天平(梅特勒-托利多公司)；CBIO-UV6 型多功能暗箱式紫外分析儀(北京賽百奧科技有限公司)；微量進樣器(上海安亭微量進樣器廠)；普通高速離心機(安徽科大創新股份有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 性狀 從顏色、形態、氣、味等方面對紫前款甘散的性狀進行觀察。

1.3.2 顯微鑒別 取過 4 號篩的樣品適量，用水合氯醛(水合氯醛 50 g，加水 15 mL 和甘油10 mL 溶解)進行透化，根據各味中藥的顯微特征在顯微鏡下進行觀察。

1.3.3 薄層鑒別 采用薄層色譜法(TLC)對處方中前胡、枇杷葉、甘草進行鑒別。

1.3.3.1 前胡的薄層鑒別 取本品3.25 g，加三氯甲烷 10 mL，超聲處理 10 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇 5 mL 使溶解，作為供試品溶液。再取白花前胡甲素對照品、白花前胡乙素對照品，加甲醇制成每 l mL 各含0.5 mg的混合溶液，作為對照品溶液。吸取上述對照品溶液 5 μL，供試品3～10 μL 分別點于同一硅膠 G 薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(3∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。

1.3.3.2 枇杷葉的薄層鑒別 取本品6.5 g，加甲醇 20 mL，超聲處理 20 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇 5 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取枇杷葉對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取熊果酸對照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述對照藥材和對照品溶液各1 μL， 供試品1～2 μL，分別點于同一硅膠 G 薄層板上，以甲苯-丙酮(5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 10%硫酸乙醇溶液，在 105 ℃ 加熱至斑點顯色清晰。

1.3.3.3 甘草的薄層鑒別 取本品13 g，加乙醚40 mL，加熱回流1 h，過濾，棄去乙醚液，藥渣加甲醇 30 mL，加熱回流 1 h，過濾，濾液蒸干，殘渣加水40 mL 使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇5 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述2種溶液各1～2 μL，分別點于同一硅膠 G 薄層板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水(30∶10∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 10%硫酸乙醇溶液，在 105 ℃ 加熱至斑點顯色清晰，置日光下檢視。

1.3.4 含量測定 應用高效液相色譜法(HPLC)測定紫前款甘散中紫菀酮的含量。

1.3.4.1 對照品溶液制備 精密稱定紫菀酮對照品適量，加乙腈制成每1 mL含0.1 mg的溶液。

1.3.4.2 供試品溶液的制備 精密稱定本品4 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇 25 mL，稱定重量，40 ℃ 溫浸1 h，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)15 min，取出放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續濾液。

茄子具有生育期短、適應能力強、喜歡高溫強光照、不耐高濕的特點。早春外界溫度較低，光照不足，因此，茄子品種選擇應該以早熟高產為目的。一般情況下，用于早春溫室大棚播種的茄子應該選擇生育期較短、對外界適應能力強、早熟穩產、耐弱光照、耐密植的優良茄子品種。

1.3.4.3 色譜條件 檢測波長 200 nm，流動相乙腈-水(96∶4)為流動相，流速 1.0 mL/min，柱溫 40 ℃， 理論板數按紫菀酮峰計算應不低于 3 500,進樣量 20 μL，Agilent Eclipse Plus C18 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

1.3.4.4 陰性供試品溶液制備 按處方比例及制備工藝制備不含紫菀藥材的紫前款甘散，按供試品溶液制備方法制備陰性供試品溶液。

1.3.4.5 專屬性考察 分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀檢測。

1.3.4.6 系統適用性試驗 按照 1.3.4.2 項下制備方法配制 6 份供試品溶液，按照上述色譜條件進行分析，記錄色譜圖。

1.3.4.7 線性關系考察 精密稱定紫菀酮對照品10.0 mg，置 25 mL 量瓶中，以乙腈溶解并稀釋制成 0.4 mg/mL 對照品儲備液。用乙腈稀釋制成 0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL 系列對照品溶液。上述各質量濃度對照品溶液按 1.3.4.3 項下色譜條件，分別進樣 20 μL，記錄色譜圖，測定其峰面積。結果以對照品相應的質量濃度為橫坐標(X,μg/μL)，對照品峰面積值為縱坐標(Y,mAU)，進行回歸計算，得標準曲線方程。

1.3.4.8 重復性試驗 對同一批號樣品，按1.3.4.2 項下平行制備6 份供試液品溶液，按1.3.4.3項下色譜條件，分別進樣 20 μL，測定。計算含量，求出紫菀酮的相對標準偏差(RSD)值。

1.3.4.9 穩定性試驗 取本品按1.3.4.2中供試品液的制備方法，制備供試品溶液，分別于 0、2、4、8 h 和12 h 進樣，記錄色譜圖，測定峰面積，求出RSD 值。

1.3.4.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批號樣品2 g，共 6 份，置 25 mL 量瓶中，分別精密加入濃度為 0.114 9 mg/mL的對照品儲備液 5.0 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過，各進樣 20 μL，計算回收率。

2 結果

2.1 性狀鑒別 本品為棕黃色至棕色的粉末，氣微香，味甜、微苦。

2.2 顯微鑒別 通過對紫前款甘散進行相關文獻及試驗研究，根據原生藥材在成藥處方中的君臣佐使，各檢出特征在鑒定中的價值及檢出的難易程度，選擇特征唯一、有唯一對應藥材、檢出頻率高的藥材粉末特征作為紫前款甘散的顯微鑒定依據。結果見中插彩版圖1：紫菀：下皮細胞長方形，垂周壁波狀彎曲，有的含紫色色素；前胡：木栓細胞淡黃色，常多層重疊，表觀呈長方形；甘草：纖維束周圍薄壁細胞含有草酸鈣方晶，形成晶纖維；款冬花：花粉粒球形，直徑約至 32 μm，外壁有刺，較尖；枇杷葉：非腺毛大型，單細胞多彎曲，完整者長約至1 260 μm。

圖1 紫前款甘散的顯微鑒別Fig.1 Microscopic identification of Ziqiankuangan powderA:紫菀，垂周壁細胞； B:前胡，木栓細胞； C:甘草，晶纖維； D:款冬花，花粉粒； E:枇杷葉，非腺毛A:Radix asteris,vertical wall cells; B:Radix peucedani,cork cells; C:Radix glycyrrhizae,crystal fiber; D:Flos farfarae, pollen grains; E:Folium eriobotryae, non-gland hairs

2.3 TLC 鑒別

2.3.1 前胡 供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。結果見中插彩版圖2。

圖2 前胡的薄層色譜圖Fig.2 Thin-layer chromatography of Radix peucedani1：混合對照品； 2～4：供試品(批號：2018061201； 2018061202； 2018061203)； 5：陰性樣品1:Mixed control sample; 2-4:Samples (batch number:2018061201; 2018061202; 2018061203); 5:Negative sample

2.3.2 枇杷葉 供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。結果見中插彩版圖3。

圖3 枇杷葉的薄層色譜圖Fig.3 Thin-layer chromatography of Folium eriobotryae1：對照藥材； 2：對照品; 3～5：供試品(批號：2018061201； 2018061202； 2018061203)； 6 陰性樣品1:Control herbs; 2:Standard sample; 3-5:Samples (batch number:2018061201; 2018061202; 2018061203); 6:Negative sample

2.3.3 甘草 供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點。結果見中插彩版圖4。

圖4 甘草的薄層色譜圖Fig.4 Thin-layer chromatography of Radix glycyrrhizae1：對照藥材； 2～4：供試品(批號：2018061201； 2018061202； 2018061203)； 5：陰性樣品1:Control herbs; 2-4:Samples (batch number:2018061201; 2018061202; 2018061203); 5:Negative sample

2.4 專屬性考察 結果顯示，在上述色譜條件下紫菀酮峰與其他峰較好的分離，陰性樣品溶液在紫菀酮相應的位置上無其他色譜峰的干擾，結果見圖5。

圖5 紫前款甘散 HPLC 色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of Ziqiankuangan powderA：紫菀酮對照品； B：供試品； C：陰性樣品A:Standard sample; B:Samples; C:Negative sample

2.5 系統適用性試驗 結果表明，紫菀酮的理論塔板數均在 10 000 以上，保留時間的 RSD小于 2%，表明該法系統適用性良好，結果見表1。

表1 紫菀酮含量測定HPLC 法系統適用性分析Table 1 System suitability analysis for determination of shionone content by HPLC

2.6 線性關系考察 結果以對照品相應的質量濃度為橫坐標(X,mg/mL)，對照品峰面積值為縱坐標(Y,mAU)，進行回歸計算，得標準曲線方程Y=25.418X+39.375(r=1)。表明紫菀酮在 0.025～0.2 mg/mL 呈良好的線性關系，結果見圖6。

圖6 紫宛酮標準曲線Fig.6 The standard curve of shionone

2.7 重復性試驗 結果顯示，紫前款甘散樣品的平均含量為 0.276 6 mg/g，RSD 為 1.98%，小于 2%，證明本含量測定方法重復性較好，結果見表2。

表2 紫菀酮含量測定重復性分析Table 2 Repeatability analysis for determination of shionone content

2.8 穩定性試驗 結果顯示，紫菀酮的峰面積 RSD 為 1.98%，該結果表明該溶液穩定性良好，結果見表3。

表3 紫菀酮含量測定溶液穩定性結果Table 3 Solution stability results for determination of shionone content

2.9 加樣回收率試驗 結果顯示，平均加樣回收率為100.17%，RSD值為1.77%，結果見表4。

表4 紫前款甘散中紫菀酮加樣回收率試驗Table 4 Test on the recovery rate of shionone in Ziqiankuangan powder

2.10 含量測定 根據峰面積計算紫菀酮平均的含量為 0.274 3 mg/g，RSD 值為 1.05%，結果見表5。

表5 供試品中紫菀酮含量測定Table 5 Determination of shionone content in the test product

3 討論

現代藥理學研究表明，紫菀、前胡、甘草、款冬花和枇杷葉具有止咳祛痰、平喘、抗炎、抗氧化等作用。由其組方所研制的紫前款甘散保持了原藥材的性味與功效，具有不需煎煮、服用方便、吸收迅速、劑量準確、安全清潔、攜帶方便等特點，對紫前款甘散質量標準控制，從顯微鑒別、薄層色譜鑒別、含量測定等指標進行，在文獻報道[5-12]基礎上，建立了紫菀、前胡、甘草、款冬花和枇杷葉的顯微鑒別，以及前胡、甘草、枇杷葉的薄層鑒別，前胡的薄層色譜鑒別中，試驗首先采用《中國獸藥典》2015 版二部前胡藥材項下收載的薄層鑒別方法以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(3∶1)為展開劑[6]，比移值較低Rf=0.44，特征斑點不夠清晰圓整，試驗中嘗試調整了極性相對較大的乙酸乙酯的比例，最終確定展開劑比例石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(3∶2)，展開系統的比移值適中Rf=0.69，分離效果好；在甘草原料藥基礎上開展了甘草的薄層考察[6]。試驗對乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)、三氯甲烷-甲醇-水(40∶10∶1)、甲苯-乙酸乙酯-甲醇(7∶3∶1)、三氯甲烷-甲醇-水(30∶10∶1)、甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(2∶2∶0.1)、甲苯-乙酸乙酯-甲醇(7∶3∶1)等展開劑進行了試驗[5-6]，結果以三氯甲烷-甲醇-水(30∶10∶1)展開系統較佳，其斑點清晰可見，分離度好，陰性對照無干擾，方法驗證可行。本試驗還對紫菀、款冬花進行了薄層鑒別，采用不同的供試品制備方法、不同展開體系、不同顯色劑和不同檢視條件[6-7]。試驗結果表明，薄層色譜斑點分離不好，尤其對照品斑點，并且陰性對照有干擾,效果不理想，因此紫菀、款冬花藥材的薄層鑒別暫不作為該制劑的質量標準。

試驗在文獻報道[13-15]色譜條件基礎上，對影響指標成分紫菀酮分離度和響應值的主要因素包括流動相、色譜柱、柱溫、流速、檢測波長進行了考察和優化。最終確定的色譜條件下，紫菀酮峰面積與進樣量呈良好的線性關系，顯示該方法對處方中紫菀酮的含量測定適用，分離度高、峰型好，陰性無干擾。

綜上所述，本試驗方法操作簡單、準確、重復性好，可用于紫前款甘散的質量控制。