狐源產超廣譜β-內酰胺酶大腸桿菌的耐藥基因型分析

馮 濤 ， 閆 爽 ， 薛 原

(東北林業大學野生動物與自然保護地學院 ， 黑龍江 哈爾濱 150040)

大腸桿菌被認為是衡量食品糞便污染的一個指標，其耐藥性和基因可以通過食物鏈轉移給人類，這對公共衛生有潛在的風險[1]。β-內酰胺類藥物是目前在臨床上最為廣泛使用的抗生素之一，超廣譜β-內酰胺酶(Extended-spectrum-β-lactamases, ESBLs)是一種由質粒介導傳播的可以水解β-內酰胺類藥物的水解酶[2]，由于抗生素的廣泛甚至不正當使用，導致多種ESBLs的基因型產生，包括TEM、OXA、CTX-M和SHV等[3]。近年來，國外已有關于產ESBLs菌株引起疾病暴發流行的報道[4]，我國對這類大腸桿菌的檢出率也在急劇增加[5]。

本試驗檢測和分析了東北地區不同狐源養殖場中ESBLs基因分布情況，旨在調查狐源中產ESBLs大腸桿菌的分子流行情況，為東北地區狐源養殖場的臨床用藥、預防和控制ESBLs基因的傳播和流行提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株 大腸桿菌質控菌株(編號為ATCC25922)，由中國獸醫藥品監察所提供；試驗菌株，于2016—2019年分離自東北不同地區狐養殖場，并分離純化和鑒定為大腸桿菌，共224株。

1.2 試劑 藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；質粒小量提取試劑盒、DNA 片段凝膠回收試劑盒，均購自愛思進生物技術有限責任公司；水解酪蛋白瓊脂培養基(Mueller-Hinton,MH)、瓊脂糖，均購自西隴科學股份有限公司；10×Buffer、dNTP、Taq酶、DL-2 000 marker、6×Loading Buffer、pMD18-T 載體、感受態細胞E.coliDH5α，均購自TaKaRa公司。

1.3 ESBLs耐藥表型的測定 ESBLs耐藥表型的檢測采用美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)[6]推薦的雙紙片法進行判定。初篩試驗中，將試驗用大腸桿菌均勻涂布于MH培養基，采用紙片擴散法，滿足頭孢他啶(CAZ)的抑菌直徑≤22 mm或頭孢噻肟(CTX)的直徑≤27 mm，樣本即可能為產ESBLs的菌株。進行確證試驗，將試驗用菌均勻涂布于MH培養基瓊脂平板，貼頭孢他啶(CAZ)、頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/Clav)為1組，頭孢噻肟(CTX)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/Clav)為2組，共兩組藥敏紙片，若任一組藥物的抑菌圈直徑差≥5 mm，即可確定為產ESBLs的菌株。

1.4 ESBLs基因型的檢測 按照參考文獻[4,7-8]設計引物序列，TEM-F:GTATCCGCTCATGAGACAATA，TEM-R:AGAAGTGGTCCTGCAACTTT；CTX-M-F:GGGCTGAGATGGTGACAAAGAG，CTX-M-R:CG TGCGAGTTCGATTTATTCAAC；SHV-F:TCTCCCTGTTAGCCACCCTG，SHV-R:CCACTGCAGCAGCTGCCG TT；OXA-F:GCAGCGCCAGTGCATCAAC，OXA-R:C CGCATCAAATGCCATAAGTG。對擴增出來的PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳驗證，膠回收純化后與pMD18-T載體連接，并轉入到感受態細胞E.coliDH5α中，將質粒樣本送至吉林庫美生物技術有限公司測序部進行序列測定，利用DNASTAR軟件分析，與GenBank的數據庫進行比較分析，確定基因型。

2 結果

2.1 ESBLs檢測 224株狐源大腸桿菌在初篩試驗中有178株為疑似產ESBLs菌株，經確證試驗，178株疑似菌株均為產ESBLs菌株，占總菌株數的79.46%(178/224)。

2.2 ESBLs基因型的檢測 在224株狐源大腸桿菌中，TEM、OXA、CTX-M型和SHV型基因擴增均出現陽性，擴增片段大小與預期目的片段相符，經測序可得，其同源性均在99%以上。

分別統計單獨攜帶和復合基因型的檢出情況，見表1。由表1可知，TEM、CTX-M、SHV和OXA陽性率依次為98.21%、75.45%、62.50%和93.30%，TEM和OXA為主要的ESBLs的基因型。同時檢出4種基因型的比例最大，為47.32%，攜帶2個及2個以上基因型的大腸桿菌高達98.21%，沒有單獨攜帶CTX-M和SHV的情況。

表1 狐源大腸桿菌產超廣譜β-內酰胺酶基因攜帶情況及基因型Table 1 Detection of genotypes of ESBLs-producing Escherichia coli strains isolated from fox

3 討論

抗生素在獸醫臨床用藥和促進動物生長發育中起到重要的作用，但是由于抗生素的廣泛使用或者使用不當等，導致細菌出現耐藥性，甚至出現多重耐藥菌。自首次發現產ESBLs菌株以來[9]，國內外各地檢出ESBLs菌株的比例越來越大。其中產ESBLs菌株在大腸桿菌和克雷伯菌中報道最多[10]。尤其需要注意的是，編碼β-內酰胺酶的基因大多位于質粒上，并且可以伴隨質粒通過接合、轉化和轉導等在細菌種內甚至種間傳播[11]，而且產ESBLs菌株所包含的質粒常常也攜帶著其他非ESBLs的耐藥基因[12]，使耐藥菌的擴散范圍越來越廣，為耐藥菌的防控和獸醫臨床治療造成了不可逆的影響。

在本次試驗中對狐源大腸桿菌進行了ESBLs耐藥表型的檢測，有178株為產ESBLs的菌株，陽性率高達79.46%。對全部試驗用大腸桿菌進行耐藥基因型的檢測，其中TEM的檢出率最高，有220株大腸桿菌表現為具有TEM型，陽性率為98.21%。Fortini等[13]對尼日利亞的健康豬進行檢測，同樣以TEM為主要的ESBLs流行基因型。國外相關研究[14]也表明，ESBLs的基因型在由TEM向CTX-M轉變。所有細菌都攜帶ESBLs耐藥基因，超過95%以上的細菌攜帶2種及2種以上的耐藥基因型，同時攜帶4種基因型的陽性率為47.32%，與曹敏等[15]報道的貴州部分地區豬源大腸桿菌ESBLs基因型的結果相似，這也證明了狐源大腸桿菌的ESBLs耐藥基因型較為復雜，對藥物極易產生耐藥情況，并且對動物的臨床治療產生了困難。

由于毛皮動物的飼養在我國占據較為重要的地位，而對其耐藥性和耐藥基因的研究工作較少，開展ESBLs的檢測和監控，用以防止多重耐藥菌的擴散和暴發，對指導獸醫臨床用藥具有一定的意義。了解ESBLs耐藥基因的流行病學規律，可以有效的評估耐藥性從動物擴散到環境甚至傳播到人類的風險。建議采用聯合用藥或者抗生素替代的方式，避免耐藥性的進一步擴散，減少耐藥菌的公共衛生安全。