靜松靈對小型豬不同腦區氨基酸類神經遞質的影響

馬相影 ， 李曉蕾 ， 申美倫 ， 張志恒 ， 李柔茜 ， 金簫迪 ， 高 利

(東北農業大學動物醫學學院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

靜松靈(鹽酸賽拉唑或者鹽酸二甲苯胺噻唑)，是一種α2-腎上腺素受體激動劑，于1974年在中國農業科學院蘭州獸醫研究所研制合成。靜松靈具有良好的鎮靜、鎮痛和肌肉松弛作用[1]。靜松靈與隆朋化學結構相似，其藥理作用更強，毒性更低，目前在我國獸醫臨床上被廣泛應用[2]。麻醉藥可改變氨基酸神經遞質含量，從而改變相應受體功能發揮麻醉機制。氨基酸類神經遞質在中樞神經系統中是重要的神經遞質[3]，在學習、記憶等方面發揮作用[4]。目前氨基酸神經遞質分為兩類：一類是興奮性神經遞質，包括谷氨酸(GLU)和天冬氨酸(ASP) ； 另一類是抑制性神經遞質，包括甘氨酸(GLY)和γ-氨基丁酸(GABA)[5]。本試驗將小型豬注射靜松靈后，觀察各腦區氨基酸類神經遞質含量的變化，探討靜松靈對不同腦區的作用部位以及在中樞神經系統中麻醉作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 靜松靈，由東北農業大學動物醫學學院臨床外科教研室提供；谷氨酸(GLU)標準品、甘氨酸(GLY)標準品、天冬氨酸(ASP)標準品、γ-氨基丁酸(GABA)標準品，批號分別為BCBB5881、109K0107、129K0181、0001446172，均購自Sigma公司。色譜級乙腈，DIMA TECHNOLOGY INC；色譜級甲醇，DIMA TECHNOLOGY INC；Waters 600 高效液相色譜儀；美國色譜柱，Symmetry C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)Column。

1.2 試驗分組 20頭小型豬，3月齡，體重10～15 kg，臨床檢測健康狀態良好。將20頭小型豬隨機分為4組，每組5頭，分別為對照組、誘導組、麻醉組和恢復組。對照組肌內注射生理鹽水[0.25 mL/(kg·bw)]，其他組肌肉注射靜松靈[0.25 mL/(kg·bw)]。

1.3 樣品采集與處理 根據試驗觀察，當小型豬注射靜松靈后，小型豬臥地不起定義為誘導期，翻正反射消失定義為麻醉期，意識逐漸清醒定義為恢復期。對照組注射生理鹽水后，將小型豬處死，立即取腦組織。其他組注射靜松靈后觀察小型豬行為，分別在誘導期、麻醉期、恢復期處死小型豬，立即取腦組織。取下的腦組織用預冷的生理鹽水沖洗血跡，并在冰面上迅速分離腦組織，稱重后放入凍存管中，用液氮凍存等待檢測。

1.4 反相高效液相色譜(RP-HPLC)檢測氨基酸神經遞質方法的建立 腦組織加研磨液研磨，離心后取上清液。將腦組織衍生。衍生條件：400 μL上清液，100 μL乙腈，400 μL NaHCO3溶液，200 μL 2，4-二 硝基氟苯，混勻，置于65 ℃恒溫水浴鍋55 min。流動相分A和B，A為醋酸鈉緩沖溶液(pH=6.5)，B為乙腈/水(比例為50∶50)，進行梯度洗脫，流動相B的濃度由開始時65%經10 min至10%，18 min時至40%；流速：0.6 mL/min；檢測波長設置360 nm；柱溫設置28 ℃。腦組織通過RP-HPLC法處理后，取20 μL進樣量，采用外標法定量分析，檢測氨基酸神經遞質的濃度。

1.5 數據處理 采用SPSS 19數據分析系統分析本試驗的數據結果，數據用平均值±標準差表示。P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 靜松靈麻醉后小型豬不同腦區神經遞質GLU的含量 如圖1所示，當小型豬注射靜松靈后，不同的腦區內GLU含量在對照組的含量最高。大腦、海馬、丘腦和腦干內GLU含量在誘導期、麻醉期和恢復期呈現逐漸下降趨勢，與對照組相比均差異極顯著(P<0.01)。小腦內GLU含量在麻醉期下降至最低，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，在恢復期上升，但含量低于正常水平(P<0.01)。

圖1 靜松靈麻醉下小型豬不同腦區GLU的含量變化Fig.1 Effects of xylazole on the GLU in different encephalic regions of pigs注：與對照組比較, *:P<0.05, **:P<0.01;下圖同Note：Compare to control group, * : P<0.05, **: P<0.01. The same as below

2.2 靜松靈麻醉后小型豬不同腦區神經遞質ASP的含量 如圖2所示，當小型豬注射靜松靈后，不同的腦區內ASP含量出現了不同的變化趨勢。海馬、丘腦和腦干內ASP含量出現相似的變化趨勢，表現先下降再上升的趨勢，在誘導期下降到最低，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，麻醉期和恢復期逐漸上升。大腦出現了相反的趨勢，在誘導期上升不顯著，在麻醉期和恢復期下降，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。小腦中ASP含量在麻醉期下降到最低，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，在恢復期逐漸恢復,但仍低于麻醉前水平(P<0.01)。

圖2 靜松靈麻醉下小型豬不同腦區ASP的含量變化Fig.2 Effects of xylazole on the ASP in different encephalic regions of pigs

2.3 靜松靈麻醉后小型豬不同腦區神經遞質GLY的含量 如圖3所示，當小型豬注射靜松靈后，不同的腦區內GLY含量出現了不同的變化趨勢。大腦和丘腦內GLY含量表現先上升再下降的趨勢，在誘導期上升到最高，與對照組相比，大腦差異極顯著(P<0.01)，丘腦差異顯著(P<0.05)，麻醉期和恢復期逐漸下降。海馬、小腦和腦干內GLY的含量先下降再上升，海馬和小腦在誘導期下降到最低，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，腦干在麻醉期下降到最低，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

圖3 靜松靈麻醉下小型豬不同腦區GLY的含量變化Fig.3 Effects of xylazole on the GLY in different encephalic regions of pigs

2.4 靜松靈麻醉后小型豬不同腦區神經遞質GABA的含量 如圖4所示，當小型豬注射靜松靈后，不同的腦區內GABA含量出現了不同的變化趨勢。大腦和丘腦內的GABA的含量表現先上升再下降的趨勢，在誘導期上升到最高，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)，麻醉期和恢復期逐漸下降。海馬和小腦內GABA的含量先下降再上升，海馬在麻醉期下降到最低，而小腦在誘導期下降到最低，與對照組相比均差異極顯著(P<0.01)。腦干各腦區GABA的含量變化，與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。

圖4 靜松靈麻醉下小型豬不同腦區GABA的含量變化Fig.4 Effects of xylazole on the GABA in different encephalic regions of pigs

3 討論

靜松靈作為一種麻醉藥，通常會改變腦內神經元的活性，導致氨基酸神經遞質的含量改變，從而改變相應受體的功能來發揮麻醉的機制。谷氨酸(GLU)和天冬氨酸(ASP)是中樞神經遞質中最主要的興奮性氨基酸神經遞質[6]。當麻醉藥作用在機體上，突觸前的神經元會產生動作電位，Ca2+內流過多，氨基酸類神經遞質胞外釋放，作用在突觸后膜的特異性受體上，產生興奮性突觸后電位，使腦內中樞神經元產生強烈的興奮作用[7]。抑制性氨基酸類神經遞質的中樞作用機制與興奮性氨基酸傳導過程相似，當抑制性氨基酸神經遞質甘氨酸(GLY)和γ-氨基丁酸(GABA)釋放時，突觸后膜對K+和Cl-的通透性增加，引起Cl-內流為主，導致突觸后膜超極化，從而產生抑制性突觸后電位，使腦內中樞神經元產生抑制作用。目前有關靜松靈復合麻醉劑對中樞系統氨基酸神經遞質的研究比較多，而靜松靈對中樞神經系統麻醉機制的研究比較少。因此，本試驗通過靜松靈對不同腦區4種氨基酸神經遞質的含量的研究，探究靜松靈對中樞神經系統可能的麻醉機制。

谷氨酸(GLU)不僅作用在神經細胞上，也作用在離子受體NMDA受體[8]。NMDA受體與鎮痛、麻醉等方面有關。GLU除了在蛋白質結構中發揮作用外，在營養、代謝和信號傳導中也起著關鍵作用。天冬氨酸(ASP)被歸類為興奮性氨基酸神經遞質，也發揮同樣的作用，但效果不如GLU強[9]。尹柏雙等[10]研究認為，鹽酸賽拉嗪的中樞麻醉作用可能與不同的腦區GLU和ASP含量的變化有關。甘氨酸(GLY)是人類大腦皮層里抑制性氨基酸神經遞質，在哺乳動物的脊髓、腦干及視網膜含量很高。當動物注射靜松靈后，GLY受體被激活，胞內Cl-濃度升高，導致抑制性突觸后電位。γ-氨基丁酸(GABA)是谷氨酸的產物，也是主要的抑制性氨基酸神經遞質之一。在生理作用下，GABA與特異性的受體結合，會改變突觸后膜的Cl-和K+通透性，引起Cl-內流或K+外流，使突觸后膜去極化，從而產生抑制性突觸后電位。有研究表明，揮發性麻醉藥主要通過增加GABA介導的突觸抑制作用來抑制大腦皮層神經元的興奮性[11]。

綜上，小型豬注射靜松靈后，小型豬小腦內興奮性神經遞質GLU和ASP在麻醉期含量下降,興奮性電位減弱。大腦和丘腦抑制性神經遞質GLY和GABA含量上升，抑制性電位增強。因此可以推測，靜松靈在中樞神經系統中作用的部位主要是小腦、大腦和丘腦。靜松靈的麻醉機制可能與抑制興奮性神經遞質釋放和促進抑制性神經遞質釋放相關。