西尼羅河病毒RT-RPA檢測方法的建立及初步應用

吳 江 ， 林彥星 ， 賈 鵬 ， 黃超華 ， 史衛軍 ， 曹琛福 ， 曾少靈 ， 孫 潔 ， 阮周曦 ， 林永濤 ， 花群義

(深圳海關動植物檢驗檢疫技術中心 ， 廣東 深圳 518045)

西尼羅河病毒(West Nile virus，WNV)是一種可以引起西尼羅河熱的單鏈RNA蟲媒病毒，可感染人類、馬及鳥類[1]，屬于黃病毒科、黃病毒屬。庫蚊是WNV傳播的主要媒介，鳥類(烏鴉、鴿子)是其自然宿主，病毒可通過“鳥-蚊-鳥、人、其他動物”的生物傳播鏈在大自然界生存。該病毒可以直接導致鳥、雞等小型動物死亡，人、馬患上可導致腦炎甚至死亡[2-4]。1937年，WNV在烏干達西尼羅河區域發現并命名[5]。2000年，以色列累計發現400多例WNV神經侵襲性病例[6]。2017年，美國報道2 000多例感染WNV的病患中，出現神經侵襲性癥狀的接近2/3[7]。鑒于WNV嚴重威脅人類健康和畜牧業發展，世界衛生組織已將該病毒疾病列為當前世界的重大流行病之一[8]。目前，我國尚未出現人感染WNV的病例報道，但WNV潛在的宿主鳥類和可能的傳播媒介蚊子在我國是存在的，頻繁的國際旅行、候鳥遷徙及進口動物及動物產品貿易，使WNV傳入風險日益提高，該病已成為我國重點防范的外來人獸共患病之一。如何快速有效地診斷該病，防止該病從國外傳入我國，已引起大眾關注。

目前，WNV病原體檢測方法包括傳統的病毒分離、普通RT-PCR、實時熒光定量PCR、Lamp、二代測序技術等。但是，這些檢測方法操作相對比較復雜，對技術人員的要求較高，檢測時間相對較長，不適用于現場檢測。重組酶聚合酶擴增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是由多種酶和蛋白參與的，可在37～42 ℃恒溫條件下進行檢測技術[9-10]。該項技術可替代一般PCR的熱循環解鏈過程，具有耗時短、成本低、檢測場地不受限制等優點[11]。為此，本研究以WNV為研究對象，篩選特異高效的RPA引物和探針，建立了快速、特異檢測WNV的實時熒光逆轉錄重組酶聚合酶擴增(RT-RPA)方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 自動磁珠提取純化設備、微量核酸定量Qubit 4及病毒RNA提取試劑盒，均購自賽默飛世爾科技公司；M-MLV逆轉錄酶及酶抑制劑，購自日本TaKaRa公司；T16-ISO等溫擴增檢測儀，購自澳大利亞AXXIN公司；TwistAmpTMexo試劑盒，購自英國Twista公司。

1.2 病原樣品和臨床樣品 本試驗用到的豬病和牛病滅活抗原：藍舌病毒(BTV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)，都保存于本中心實驗室；WNV的e基因的質粒標準品WNV-e由本中心構建；?；蜇i臨床滅活樣品由本中心病免室收集。

1.3 引物和探針合成 根據WNV的保守區域e基因序列，使用Primer Explorer Version 4(http://primerexplorer.jp/e)軟件，在線設計引物和探針。引物和探針合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 核酸提取 按照抽提試劑盒的操作說明，使用自動磁珠提取純化系統，從?；蜇i血液樣品及其他滅活病毒抗原中提取核酸，-80 ℃保存備用。

1.5 反應體系和條件 本反應使用TwistAmpTMexo試劑：將試劑盒中RPA凍干酶粉反應管放置于冰上，加入溶解緩沖液29.5 μL，M-MLV逆轉錄酶(200 U/μL) 1 μL,10 μmol/L的上下游引物各2.1 μL， RNA酶抑制劑(40 U/μL) 1 μL，10 μmol/L的探針0.6 μL，DEPC水和核酸模板12.2 μL。充分混合勻均上述試劑后加入280 mmol/L的醋酸鎂溶液2.5 μL，共50 μL。配置好上述反應液后，立即放入恒溫擴增儀擴增。反應溫度選擇39 ℃，反應時間選擇20 min。

1.6 引物探針篩選 將合成的多條探針和多對引物進行配對組合，分組進行RT-RPA檢測，篩選較優組合。

1.7 特異性試驗 應用建立的RT-RPA方法，對本中心保存的BVDV、JEV、PRRSV、CSFV和BTV等核酸模板進行特異性檢測，以WNV-e質粒標準品為陽性對照，設立無核酸水模板為空白對照，驗證WNV的RT-RPA檢測方法的特異性。

1.8 靈敏度試驗 應用建立的RT-RPA方法，用DEPC水對WNV-e質粒標準品進行10×倍比稀釋，每個檢測孔收集FAM熒光信號，各取2 μL模板(稀釋度100～10-6)進行RT-RPA試驗,以確定本方法最低檢測限。同時，使用李林海等[12]建立的WNV實時熒光PCR方法進行平行檢測，比較2種方法的靈敏度。

1.9 重復性試驗 選取3個稀釋梯度(10-1～10-3)的WNV-e標準品作為模板，采用創建的實時熒光RT-RPA進行檢測，重復檢測6次，分析反應體系的穩定性。

1.10 臨床檢測 應用建立的方法對本中心保存的72份牛或豬的臨床樣品進行測試，設置WNV-e質粒標準品為陽性對照，DEPC水作為陰性對照。同時采用李林海等[12]建立的實時熒光PCR方法測試，對比2種方法的檢測結果，并計算2種方法的符合性。

2 結果

2.1 引物探針的篩選 采用矩陣法兩兩組合篩選結果表明，F4/R5這對引物和P2探針組合擴增效率最高(表1)。

表1 RT-RPA方法最佳引物及探針核苷酸序列Table 1 Optimal primer and probe nucleotide sequence for RT-RPA method

2.2 特異性試驗 使用稀釋度為10-1的WNV-e質粒標準品和提取的BVDV、JEV、PRRSV、CSFV和BTV的核酸為模板，應用建立的RT-RPA方法擴增。結果顯示，WNV-e模板在反應后220 s收集到FAM熒光信號，且隨著反應進行熒光信號不斷增強，出現典型的S型擴增曲線；其他豬或牛病原核酸模板和空白對照均未出現擴增熒光曲線(中插彩版圖1)。表明本方法特異性較強，能準確檢測到WNV，與其他病原核酸無交叉反應，與試驗設計相符。

圖1 實時熒光RT-RPA特異性檢測Fig.1 Specificity test of real-time RT-RPA assay1：WNV-e； 2：BVDV； 3：JEV； 4：PRRSV； 5：CSFV； 6：BTV； 7：陰性對照； 8：空白對照1：WNV-e； 2：BVDV； 3：JEV； 4：PRRSV； 5：CSFV； 6：BTV； 7：Negative control； 8：Blank control

2.3 靈敏度試驗 使用微量核酸定量Qubit 4熒光計，測得WNV-e標準品初始拷貝數為5.25×106拷貝/μL。 選擇稀釋度100～10-6的7個WNV-e標準品作為模板，使用創建的實時熒光RT-RPA方法檢測。結果顯示(中插彩版圖2)，WNV-e質粒標準品在稀釋度為10-4時檢測仍有熒光曲線，對應最低檢測拷貝數為5.25×102拷貝/μL。使用李林海等[12]建立的實時熒光定量PCR檢測法開展檢測，結果顯示(中插彩版圖3)，WNV-e標準品在稀釋度為10-5時檢測出現熒光曲線，最低檢測拷貝數為5.25×101拷貝/μL。雖然本研究創建的RPA方法靈敏度比實時熒光定量PCR法低1個數量級，但是，RT-RPA方法優勢獨特，從4 min開始可觀察到擴增曲線，反應條件簡單且無需大型儀器設備，檢測時間不到熒光PCR的1/3，檢測效率更高。

圖2 實時熒光RT-RPA靈敏度檢測Fig.2 Sensitivity test of real-time RT-RPA assay1～4：WNV稀釋度分別為10-1、10-2、10-3、10-4； 5～6：WNV稀釋度分別為10-5、10-6； 7：空白對照1-4:WNV dilution were 10-1，10-2，10-3，10-4，respectively； 5-6:WNV dilution were 10-5，10-6，respectively； 7：Blank control

圖3 實時熒光PCR方法檢測結果Fig.3 Results of real-time PCR method1～6：WNV-e稀釋度分別為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-51-6：WNV-e dilution were 100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5， respectively

2.4 重復性試驗 將10-1、10-2、10-3三種濃度的WNV-e質粒分別用RT-RPA法重復檢測6次，均可觀察到相應的熒光曲線，相同濃度模板檢測結果一致，表明本方法重復性能夠滿足檢測需要。

2.5 臨床樣品檢測 采用建立的RT-PCR方法和實時熒光PCR方法，對本中心實驗室收集的72份滅活?；蜇i的臨床樣品進行檢測，分別以WNV-e質粒為陽性對照。結果顯示，WNV有13份陽性核酸出現典型的擴增曲線，結果與實時熒光定量PCR法符合率為100%。

3 討論

西尼羅河病毒一直威脅著人類健康和畜牧業的發展，一旦暴發可導致嚴重的公共衛生問題。近年來，由于人員流動和國際貿易增加，面臨WNV入侵的風險不斷加大。截至目前，我國沒有發現人感染WNV的病例報道，但已有研究人員在新疆部分區域的蚊蟲樣品中分離出與1999年美國暴發的相同進化分支的WNV[13]。為此，我們仍需要為WNV的入侵做好應對。目前，尚無針對WNV的有效治療措施，對此病的預防需要依賴實驗室診斷和養殖過程防控。因此，建立一種簡便、快捷、準確的WNV檢測方法，將有助于盡早阻斷病原體的傳播，降低人類感染風險，減少經濟損失。

RPA是一種在恒溫條件下，通過與熒光探針結合即可實現對核酸擴增實時監測的檢測新技術[14]。在反應體系中加入逆轉錄酶，可一步快速擴增RNA模板，總反應時間少于20 min。結合熒光探針使用的實時RPA檢測技術，可以在便于攜帶的恒溫擴增熒光檢測器中直接讀取檢測結果。目前，RPA引物探針的設計尚無專門的程序。本研究通過大量試驗篩選引物及探針組合，建立了WNV實時熒光RT-RPA方法。結果表明，本研究建立的RT-RPA法操作簡便，特異性強，與常見豬病病毒核酸檢測沒有出現交叉反應；靈敏性比實時熒光定量PCR稍低，可檢測最低拷貝數為102拷貝/μL的WNV陽性核酸。本研究建立的WNV RT-RPA方法比李林海等[12]建立的實時熒光定量PCR法低1個數量級的原因，可能為RT-RPA擴增體系中存在大量蛋白酶干擾反應的進行[15]。本研究所建立的實時熒光RT-RPA法反應程序簡單，無需復雜儀器設備；反應時間短，反應時間不到實時熒光PCR的1/3。本研究將72份臨床樣品用于所建立方法的臨床應用，2種方法的檢測結果一致，表明該方法的實用性較強。

綜上所述，本研究建立的檢測西尼羅河病毒RT-RPA檢測方法操作簡單，反應靈敏，結果可靠，儀器依賴度低，適用于WNV監測、基層實驗室或出入境口岸對WNV的現場快速檢測，為WNV病毒病的防控提供了技術支撐。