非洲豬瘟病毒膠體金免疫層析試紙條的研制

鄔旭龍 ， 劉 波 ， 王 印 ， 張鵬飛 ， 江地科 ， 肖 璐

(1. 成都農業科技職業學院 ， 四川 成都 611130 ； 2. 四川農業大學動物醫學院 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室 ， 四川 成都 611130 ； 3. 四川省畜牧科學研究院 動物遺傳育種四川省重點實驗室 ， 四川 成都 610066)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的豬的急性傳染病[1]。ASFV屬非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)，是蟲媒病毒中唯一的DNA病毒，臨床表現與豬瘟極其相似[2]，以急性高熱為特點，伴有全身及內臟器官出血，豬群一旦感染，強毒株可引起100%死亡率[3]。臨床癥狀從急性、亞急性和慢性不等，表現為高熱、皮膚發紺、呼吸障礙和神經癥狀等[4-5]，病癥最急性型可感染任何年齡和品種的豬群，通常出現在初次感染豬場，豬群感染后3～7 d可出現死亡[6]，對養豬業造成巨大經濟損失，目前仍無有效的ASF疫苗進行預防，該病被世界動物衛生組織列為實時通報的動物疾病，我國將其列為一類動物疫病。

膠體金技術從20世紀70年代開始，逐漸在各不同學科領域開展研究和應用[7-9]?；驹韀10]是由于膠體金顆粒表面帶有負電荷，因而可以通過靜電作用吸附帶有正電的物質，膠體金標記的抗原或抗體在毛細作用下在硝酸纖維素膜中移動并與相應的抗體或抗原作用反應結合，從而導致大量膠體金顆粒的聚集，進而呈現顯色反應。ASFV pK205R蛋白是ASFV的主要抗原之一[11-12]，可以誘導機體產生較強的免疫反應，該研究通過原核表達ASFV pK205R蛋白并制備多克隆抗體，初步建立檢測ASFV的膠體金免疫層析試紙條檢測方法，該方法快速、便捷，且具有較好的特異性，為非洲豬瘟病毒臨床檢測技術研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 大腸桿菌BL21，購自天根生化科技(北京)有限公司。pMD19-T Simple Vector、pET-32a，均購自TaKaRa公司。DNA Marker DL2 000、蛋白質Marker，均購自天根生化科技(北京)有限公司；NotⅠ、BglⅡ限制性內切酶、TaqPlus DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、非預染蛋白質Marker、高保真酶、Primer Star，10× PyrobestTMBuffer、dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)、DNA Marker DL10 000，均購自TaKaRa公司；HisTrap FF 5×1 mL蛋白純化柱，購自美國GE公司；其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器 超速低溫離心機，Beckman公司產品；冷凍干燥儀，Thermo公司產品；PCR儀、全自動凝膠圖像分析系統，Bio-Rad公司產品；分光光度計，上海美光達儀器有限公司產品；電熱恒溫干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物合成 根據GenBank登錄的ASFVK205R基因序列(FR682468.1)，人工合成K205R基因，設計合成引物，引物序列：5′-AGATCTATGGTTGAGCCACGCGAACAGTT-3′(下劃線為BglⅡ酶切位點)；5′-GCGGCCGCCGCTTACTTCTTCATCATCT CTV-3′(下劃線為NotⅠ酶切位點)。PCR擴增產物條帶大小約為636 bp，回收目的片段后與pMD-19T載體連接，轉化到DH5α細胞，利用BglⅡ和NotⅠ進行雙酶切鑒定，對鑒定正確的陽性質粒測序。

1.3.2 ASFV pK205R蛋白原核表達 雙酶切的pMD-19T-K205R載體與pET-32a載體進行連接，構建表達質粒pET-32a-K205R并轉化至BL21，重組菌株擴大培養后加入IPTG誘導，分別對誘導時間、溫度、IPTG濃度優化，同時設立陰性對照，誘導后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定。

1.3.3 重組蛋白純化 表達重組蛋白利用His標簽蛋白純化柱純化后經SDS-PAGE電泳鑒定，純化的目的蛋白濃縮至8 mg/mL左右，與佐劑1∶2比例混合乳化免疫家兔2 mL，每隔7～10 d加強免疫，第3次免疫10 d后心臟采血，分離血清備用。并利用親合層析純化柱純化血清中的IgG，使用半透膜4 ℃ 透析過夜，-20 ℃保存。

1.3.4 多克隆抗體制備 將純化的目的蛋白濃縮至8 mg/mL左右，與白油佐劑1∶2比例混合乳化免疫家兔2 mL，每隔10 d加強免疫，劑量每次增加0.5 mL，第3次免疫后采用心臟采血，分離血清備用。制備陽性血清，并利用GE Healthcare Protein G SepharoseTM親合層析純化柱純化血清中IgG，使用半透膜4 ℃透析過夜，-20 ℃保存。

1.3.5 金標抗體制備 分別對免疫膠體金最適pH及最適抗體量進行測定。在離心管中分別加入1 mL膠體金溶液，用0.2 mol/L的K2CO3溶液分別調節pH為3～9.5，每管加入BSA混勻，室溫放置30 min后離心重懸，觀察膠體金顏色變化，確定最適pH條件。同時，對膠體金標記最適抗體進行篩選，系列稀釋純化的多克隆抗體使其濃度為5～55 μg/mL，加入96孔板中，室溫靜置30 min，觀察結果確定最適的金標抗體量。

1.3.6 試紙條組裝及檢測 樣品墊(聚酯纖維素膜)用樣品墊預處理液[0.5 mol/L PBS溶液(含0.1%Tween-20)，pH 7.4]浸泡1 h，真空抽干備用；金標墊(玻璃纖維素膜)用金標墊處理液(4%蔗糖)浸泡1 h，真空抽干放入金標抗體溶液中浸泡1 h，再次真空抽干；硝酸纖維素膜用硝酸纖維素膜處理液(0.5 mol/L PBS溶液，pH 7.4)浸泡1 h，再用超純水浸泡3次，真空抽干。將純化的抗體和SPA分別劃線于T線和C線處，室溫干燥備用。依次將樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水紙粘在PVC底板上，并依次重疊，使勁壓緊，裁成合適大小的試紙條；取一制備的試紙條，在樣品墊上滴加100 μL純化的目的蛋白，10～20 min后觀察效果。

1.3.7 試紙條劃線濃度的優化 將純化的抗體進行系列稀釋(4～0.1 mg/mL)，劃線于硝酸纖維素膜的T線處，點樣檢測，確定最適T線抗體濃度。將SPA進行系列稀釋(4～0.025 mg/mL)，劃線于硝酸纖維素膜的C線處，點樣檢測，確定最適C線SPA濃度。

1.3.8 試紙條檢測性能研究 分別對制備的膠體金試紙條進行檢測靈敏度和特異性測試。在確定的優化條件下制作金標試紙條，把純化的ASFV pK205R表達蛋白稀釋成不同濃度后點樣，進行靈敏性檢測。同時，將BL21大腸桿菌裂解液、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、圓環病毒2型(PCV2)、生理鹽水和陽性蛋白樣品分別滴在試紙條上，進行特異性檢測。

2 結果

2.1 基因擴增及表達載體鑒定 特異性引物進行PCR擴增后，經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，擴增產物條帶大小約636 bp，與預期大小一致(圖1A)。表達質粒雙酶切后電泳鑒定，結果顯示出現2條特異性條帶，大小約636 bp和5 900 bp，與預期大小一致(圖1B)，表明成功構建表達質粒pET-32a-K205R。

圖1 ASFV K205R基因擴增及重組表達載體酶切鑒定Fig.1 Amplification of ASFV K205R and identification of recombinant expression vectorM1：DL2 000 DNA相對分子質量標準； 1：K205R PCR擴增產物； M2：DL10 000 DNA相對分子質量標準； 2：重組表達質粒pET-32a-K205R； 3：pET-32a空載體質粒； 4：重組表達質粒雙酶切產物M1:DNA marker DL2 000; 1:PCR amplification products of K205R; M2:DNA marker DL10 000; 2:Recombinant expression plasmid pET-32a-K205R; 3:pET-32a empty vector plasmid; 4:Double enzyme digestion products of pET-32a-K205R

2.2 重組蛋白表達及純化 重組表達質粒轉入BL21中誘導表達，同時設立空載質粒對照，進行SDS-PAGE電泳鑒定。結果顯示，pK205R重組蛋白大小約44 kDa，與預期大小一致(圖2A)。利用His標簽純化柱對表達蛋白純化后電泳，重組蛋白在44 kDa處出現特異性條帶(圖2B)，表明pK205R重組蛋白成功表達及純化。

圖2 重組蛋白表達及純化Fig.2 Expression and purification of recombinant proteinM：蛋白分子量標準； 1：pET-32a-K205R重組菌誘導表達； 2：空載菌誘導表達； 3：重組蛋白的純化M:Protein molecular weight marker; 1:The expression product of pET32a-K205R; 2:The expression product induced by emptyvector control; 3:Purified recombinant protein

2.3 金標抗體的制備 加入適量K2CO3溶液調節膠體金pH為3～9.5，結果顯示，當pH為7.5～9時，膠體金穩定，顏色不變，重復試驗后選擇標記蛋白的最適pH為7.5。加入不同濃度的純化抗體，結果顯示(表1)，使膠體金穩定而顏色保持不變的最小抗體濃度為35～40 μg/mL，為保證試紙條檢測質量，選擇抗體標記量為40 μg/mL。

表1 金標抗體的制備Table 1 Preparation of gold labeled antibody

2.4 試紙條的檢測 將試紙條預處理后進行組裝，在樣品墊上滴加100 μL純化的表達重組蛋白，10～20 min后觀察結果。結果顯示，控制線和檢測線清晰可見(中插彩版圖3)，表示免疫膠體金標記成功，試紙條制作成功。

圖3 試紙條檢測Fig.3 The test of the strip

2.5 膠體金試紙條的優化 純化的抗體系列稀釋后分別劃線于T線處，點樣檢測，結果顯示，所有濃度均能顯色(中插彩版圖4)，由于抗體濃度減小可能會導致顯色不清晰，將T線抗體濃度確定為1.5 mg/mL。

圖4 T線和C線標記濃度的優化Fig.4 Optimization of the antibody concentration in T-line and C-line1～8: T線標記抗體濃度分別為4、2、1.5、1、0.75、0.5、0.25 mg/mL和0.1 mg/mL； 9～19： C線標記SPA濃度分別為4、2、1.5、1、0.75、0.5、0.25、0.1、0.075、0.05 mg/mL和0.025 mg/mL1-8： Concentrations of T-line labeled antibody were 4、2、1.5、1、0.75、0.5、0.25 mg/mL and 0.1 mg/mL, respectively; 9-19: Concentrations of SPA labeled with C-line were 4、2、1.5、1、0.75、0.5、0.25、0.1、0.075、0.05 mg/mL and 0.025 mg/mL, respectively

SPA系列稀釋后分別劃線于C線處，點樣檢測，結果顯示，當SPA濃度不小于2 mg/mL時，顯色最為明顯，可確定C線標記SPA最適濃度為2 mg/mL。

2.6 靈敏性檢測 將制備的試紙條進行靈敏性檢測，純化的重組蛋白稀釋為50～5 ng/mL，結果顯示，當蛋白濃度為30 ng/mL時，檢測結果為陽性；當濃度低于30 ng/mL時，結果為陰性(表2)。表明該方法對重組蛋白的最小檢測量約為30 ng/mL。

表2 試紙條靈敏性試驗Table 2 The sensitivity test of strip

2.7 特異性檢測 將制備的膠體金試紙條進行特異性檢測，分別將大腸桿菌、CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、陰性對照和陽性蛋白樣品分別滴在試紙條上，結果顯示，除陽性樣品外，其余結果均為陰性(表3)，表明制備的膠體金試紙條具有較好的特異性。

表3 試紙條特異性檢測Table 3 The specificity test of strip

3 討論

ASF目前無有效疫苗進行防控，針對該病預防主要通過生物安全措施和檢疫，因此建立一種ASFV快速簡便的檢測方法尤為重要。K205R基因作為ASFV保守特異的基因，病毒在感染動物初期最先得到大量復制[13]，使得K205R基因逐漸受到國內外越來越多的關注，并且pK205R蛋白能夠在病毒侵入機體的早期表達這一特性，為建立快速及時檢測ASFV提供了技術儲備，為ASFV進一步基礎研究提供有效的參考依據。

大腸桿菌作為原核表達宿主細胞，是重組蛋白表達應用較為廣泛的表達系統，具有廉價、易于操作的優點，而且目前對大腸桿菌的遺傳情況比較了解，使其成為外源基因表達的首先體系。本試驗將構建成功含ASFVK205R基因的重組質粒導入BL21大腸桿菌，通過條件優化和誘導獲得大量表達的重組蛋白，并通過純化柱純化蛋白，制備兔抗多克隆抗體，為初步研制ASFV膠體金試紙條檢測方法提供了保障。

膠體金免疫層析技術因具有方便、快捷等特點，已在多個領域有廣泛的應用，隨著膠體金技術不斷的創新和改進，使該檢測方法日益成為科學研究和臨床診斷的有力工具。本試驗用金顆粒標記純化的兔抗pK205R抗體作為金標墊，同時純化的抗體作為檢測T線捕獲抗原，用SPA作為質控C線，并對工作條件進行優化。經檢測所研制的膠體金試紙條能與模擬陽性樣品反應，操作簡便、檢測快速，反應條帶清晰可見，且具有較高的檢測特異性。本試驗為進一步優化和研究該ASFV膠體金試紙條檢測方法，獲得更加靈敏、穩定的檢測結果，從而開展臨床檢測的推廣和應用提供了科學依據。