非洲豬瘟病毒實時熒光環介導等溫擴增方法的建立

王宏燕 ， 楊作豐 ， 李秀梅 ， 楊利敏 ， 邊 際 ， 董 娜 ， 張立國

(1. 遼寧省農業發展服務中心 ， 遼寧 沈陽 110032 ； 2. 洛陽現代生物技術研究院有限公司 ， 河南 洛陽 471000 ； 3. 中國科學院微生物研究所 ， 北京 海淀 100080 ； 4. 沈陽市農業綜合行政執法隊 ， 遼寧 沈陽 110031)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的豬的烈性傳染病，通常表現出高熱、全身出血、呼吸障礙和神經癥狀等主要臨床癥狀，具有病程短、病死率高等特征[1]。該病是我國一類動物疫病，也是世界動物衛生組織(OIE)法定報告的動物疫病之一，ASFV 不感染人，對人的健康不構成威脅。目前，針對ASF防控，尚無有效的商品化疫苗。ASFV基因組為線狀雙股DNA，全長170～190 kb，整個基因組有151個開放閱讀框(ORF)，可以編碼150～200種蛋白質，其中B646L基因編碼的p72蛋白是ASFV的一種主要的衣殼結構蛋白，是重要抗原之一[2]。

環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新型核酸擴增技術，在恒溫條件下利用Bst DNA聚合酶和根據靶序列設計的3對特殊引物，特異性識別靶序列上的6個獨立區域[3]，啟動循環鏈置換反應產生啞鈴狀DNA，并以自身為模板，進行DNA合成延伸，形成莖-環DNA結構。本試驗基于LAMP技術原理，利用實時熒光技術，建立了一種快速、靈敏的ASFV檢測方法，該方法特異性強、靈敏度高，為ASFV臨床診斷提供了一種可靠的方法和手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 豬偽狂犬活疫苗和豬圓環病毒2型活疫苗，均購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所；豬瘟活疫苗，購自中牧實業股份有限公司；高致病性豬呼吸與繁殖綜合征活疫苗(JXA1-R)，購自廣東大華農動物保健品股份有限公司；豬細小病毒病滅活疫苗(YBF01株)，購自易邦生物有限公司；37 個臨床樣品由中國動物疫病預防控制中心惠贈。

1.2 主要試劑盒耗材 Bst enzyme為商品化DNA聚合酶，購自美國NEB公司；D-I礦物油，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物訂自生工生物工程(上海)股份有限公司；病毒 DNA/RNA 提取試劑盒(R4410-03)，購自Magen公司。

1.3 儀器與設備 -80 ℃凍存柜、高速臺式離心機、微量移液器、超微量分光光度計，均購自美國Thermo Fisher公司；漩渦混合器，購自德國IKA公司；恒溫LAMP擴增儀，購自杭州奧盛儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 引物設計 根據非洲豬瘟病毒B646L基因的保守結構域設計3對引物，包括1對內引物(FIP與BIP)、1對外引物(F3與B3)和1對環引物(LF與LB)，LAMP TaqMan探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體引物序列見表1。取3對引物(FIP、BIP、F3、B3、LF和LB)干粉和LAMP TaqMan探針干粉，按說明書分別加入適量無菌純化水，溶解混勻，得到各引物溶液，置-20 ℃保存。

表1 LAMP引物序列Table 1 LAMP primer sequences

1.4.2 病毒DNA的提取 ASFV DNA提取參照Magen公司的病毒DNA/RNA 提取試劑盒(R4410-03)說明書進行操作，將提取的DNA用DNA 酶水溶解，于-80 ℃保存。

1.4.3 陽性質粒的構建 以非洲豬瘟病毒B646L基因為模板，用特異性引物F：5′-TTAGGTACTGTAACGCAGCACAGCT-3′、R：5′-ATGGCATCAGGAGGA-GCTTTTTG-3′進行PCR反應，將目的片段回收后與 pMD18-T 載體進行連接，轉化DH-5α感受態細胞后挑菌培養，PCR及LAMP方法驗證克隆。

1.4.4 ASFV-R-Mix的配制 稱取2.4 g Tris，0.37 g氯化鉀，0.12 g硫酸鎂，100 μL吐溫-20，7.029 g甜菜堿，溶于80 mL純化水，依次加入終濃度為1.4 mmol/L dNTPs溶液、0.2 μmmo/L外引物溶液、1.6 μmol/L內引物溶液、0.8 μmol/L環引物溶液、LAMP TaqMan探針，加入無菌純化水定容至100 mL， 經過0.22 μm濾器過濾除菌，分裝至2 mL藍蓋可立凍存管中，1.1 mL/管，-20 ℃保存。

1.4.5 Bst enzyme的制備 用于制備本試劑盒的Bst enzyme為商品化DNA聚合酶(美國NEB公司)，按使用說明書用純化水稀釋至4×106/L，分裝至0.5 mL白蓋可立凍存管中，-20 ℃保存。

1.4.6 反應體系的建立 22 μL ASFV-R-Mix、1 μL Bst enzyme和2 μL DNA模板加入同一個PCR管，混勻，用10 μL D-I礦物油輕輕加至PCR管液面，將反應混合物置于到恒溫擴增儀反應槽中，65 ℃恒溫反應12 min，熒光采集周期20 s。

1.5 特異性試驗 以豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(High pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)和豬圓環病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2) 5種病原疫苗為特異性對照，分別以上述病毒的核酸為檢測模板，驗證該檢測方法的特異性。

1.6 靈敏度試驗 用超微量分光光度計測定質粒濃度，將質粒進行10倍倍比稀釋，稀釋度從10-1到10-5，濃度分別為1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、 100 fg/μL，每個稀釋度取2 μL作為模板加入到 1.4.6 建立的反應體系中進行恒溫擴增，驗證該檢測方法的敏感性。

1.7 臨床樣品檢測 用建立的AFSV real-time LAMP檢測方法對37個臨床樣品進行檢測，評價并比較實際應用性。

1.8 與其他檢測方法的比較分析 為確定本試驗的特異性、靈敏度和實際應用效果，用OIE推薦的實時熒光定量PCR檢測方法[4]，對1.5、1.6及1.7中的模板進行擴增反應。

2 結果

2.1 Real-time LAMP檢測ASFV的特異性 以CSFV、HP-PRRSV、PRV、PPV和PCV2五種病原疫苗的DNA為對照檢測模板，超純水為陰性對照，測試本試驗建立的ASFV real-time LAMP檢測方法的特異性。結果如圖1所示，試驗結果顯示：ASFV real-time LAMP檢測方法僅對陽性對照出現特異的S型擴增曲線，陰性對照和上述5種病原疫苗均未發生擴增。與OIE推薦的實時熒光定量PCR方法的檢測結果一致,見表2。結果表明本試驗建立的real-time LAMP檢測方法具有良好的特異性。

圖1 非洲豬瘟病毒實時熒光環介導等溫擴增方法特異性試驗Fig.1 Specificity test of real-time LAMP for detection of ASFV

表2 非洲豬瘟病毒實時熒光環介導等溫擴增與OIE推薦的實時熒光定量PCR特異性結果對比Table 2 Comparison of specificity between ASFV real-time LAMP and qPCR recommended by OIE

2.2 Real-time LAMP檢測 ASFV的靈敏度 構建含ASFV real-time LAMP擴增靶位點的質粒，用超微量分光光度計測定質粒濃度，將質粒進行10倍倍比稀釋，稀釋度從10-1到10-5，分別作為模板進行擴增，每個樣本進行3次重復試驗，以純化水作為陰性對照，結果見封二彩版圖2。與OIE推薦的實時熒光定量PCR檢測上述各稀釋度模板的結果比較見表3。結果顯示，ASFV real-time LAMP方法能檢測到最低質粒濃度為1 pg/μL，與OIE推薦的實時熒光定量PCR方法靈敏度相當。

圖2 非洲豬瘟病毒實時熒光環介導等溫擴增敏感性試驗Fig.2 Sensitivity test of real-time LAMP for detection of ASFV

2.3 臨床樣品的檢測 通過對37個臨床樣品進行檢測，結果見表4，本試驗建立的real-time LAMP與OIE推薦的實時熒光定量PCR方法檢出的結果一致。

表4 臨床樣品ASFV檢測結果Table 4 Results of clinical samples for detection of ASFV

3 討論

我國非洲豬瘟疫情防控形勢十分復雜嚴峻。自2018年8月3日遼寧省沈陽市沈北新區某養殖場被確診發生我國第一起非洲豬瘟疫情以來，非洲豬瘟已在我國大部分省市發生，給我國養豬產業造成了毀滅性的打擊。目前，非洲豬瘟沒有有效的治療藥物，也沒有有效的滅活疫苗或弱毒疫苗，一旦確診感染，撲殺并無害化處理是防止病原擴散最有效的控制手段。

分子生物學方法是ASFV重要的診斷工具。本試驗將TaqMan探針應用于LAMP擴增體系后，與采用SYBR Green、濁度等各種顯色方法相比[5]，能產生高特異性的信號，為LAMP技術更加廣泛的應用于臨床診斷提供數據支持。本試驗通過特異性、靈敏性試驗，對豬瘟病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒、豬細小病毒和豬圓環病毒2型5種病原疫苗的檢測均為陰性，特異性良好；且在DNA模板濃度為1 pg/μL時仍能擴增出目的片段，靈敏度良好。與OIE推薦的實時熒光定量PCR相比，其特異性和敏感性相當，對37份臨床樣品的檢測結果一致。

本試驗建立的real-time LAMP方法與常規PCR方法比較，LAMP引物針對模板6個區段，其特異性更高，無假陽性；擴增過程無需變性與退火，反應時間僅需12 min，適宜高通量大規模篩查，可減少人工操作，結果判定準確可靠，其技術優勢可在快速診斷和疫情防控工作中進一步發揮作用。