沂蒙草雞J亞群禽白血病病毒分離鑒定及遺傳變異分析

牛建蕊 ， 王 靜 ， 王培坤 ， 薛 聰 ， 韓照清 ， 于 洋 ， 王 媛 ， 張興林

(1. 臨沂大學微生物與宿主健康研究所 ， 山東 臨沂 276005 ； 2.臨沂市蘭山區畜牧發展促進中心 ， 山東 臨沂 276005)

禽白血病(Avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的以腫瘤發生和免疫抑制為特征的禽類疾病[1]。AL感染雞的有A～E、J和K共7個亞群[2]，其中J亞群(Subgroup J of ALV,ALV-J)為感染雞的主要外源性病毒，B、C、D亞群在臨床上少見[3]，E亞群為內源性病毒，不具有致瘤性[4]。ALV-J于1988年在英國白羽肉雞中首次發現，隨后在全球范圍內的廣泛傳播，給養禽業造成巨大經濟損失[5]。杜巖等[6]于20世紀末，首次報道在中國商品代白羽肉雞分離到ALV-J，ALV-J隨后在我國各品種雞群中廣泛傳播，給我國養禽業帶來巨大經濟損失[7-8]。

目前尚無有效商業化疫苗和藥物可以防控AL，種群凈化是控制該病有效的方式。我國部分大型育種公司開展實施的ALV凈化工作效果顯著。然而在地方品種雞群，ALV感染雞群情況仍然較為多發[9]。沂蒙草雞是沂蒙山地區野外放養的本地柴雞，品種優良，深受消費者喜愛，養殖規模逐年擴大。2020年上半年，部分養殖戶反映在飼養過程中有部分雞只出現內臟腫瘤死亡。為了確診這些病例，同時了解沂蒙草雞ALV感染情況，本試驗針對沂蒙草雞開展禽白血病流行病學調查。從沂蒙草雞養殖場禽白血病病毒p27抗原陽性雞中分離、鑒定出1株ALV-J，并完成了全基因序列測定及遺傳變異分析，為沂蒙地區禽白血病防控提供一定科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品與細胞 從沂蒙地區2個規模較大的沂蒙草雞養殖場，分別各采集母雞血漿46份，公雞血漿46份，共184份樣品。DF-1細胞由臨沂大學微生物與宿主健康研究所保存。

1.2 主要試劑 ALV-p27 抗原檢測試劑盒，購自北京天之泰生物科技有限公司；組織DNA抽提試劑盒購、凝膠回收試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司；2×Phanta Max Master Mix 高保真酶、PCR buffer (含Mg2+) ，均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DH5α大腸桿菌感受態細胞、pMD18-T載體，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 病毒分離 按照文獻[3]步驟將樣品接種DF-1 細胞做病毒分離，9 d后收集細胞培養物。

1.4 細胞培養物ELISA檢測 按照ALV-p27 抗原ELISA檢測試劑盒說明書操作，檢測細胞培養物中是否含有ALV-p27抗原。

1.5 PCR分型鑒定 鑒定出ALV-p27抗原陽性樣品，重新進行病毒增殖培養并收集細胞培養物。按照DNA抽提試劑盒說明書，抽提細胞培養物中DNA，并分別用ALV各亞群鑒定引物進行鑒定。分型鑒定引物參照文獻[3]設計并由華大基因科技服務有限公司合成，引物名稱及序列以及目的片段大小見表1。

表1 本試驗所用的引物Table 1 The primers used in this study

1.6 ALV-J全基因組序列測定 參照ALV-J原型株HPRS-103前病毒基因組序列，設計3對互相重疊的特異性引物，如表1所示。以鑒定為ALV-J陽性的病毒DNA為模板進行PCR擴增[1]。PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳后回收、純化，隨后將純化產物連接至pMD-18T載體，轉化DH5α大腸桿菌感受態細胞，菌液PCR鑒定陽性后，每個片段挑選3個陽性質粒送華大基因科技服務有限公司測序。

1.7 序列分析 利用DNASTAR(Ver 7.1.0)對測序結果進行拼接進而獲得完整病毒序列，對相應基因進行相似性比較分析。MEGA X(Ver 10.1.7)將獲得全基因組序列與參考序列進行比較分析，利用最大似然法(Maximum likelihood method)構建系統發育樹。利用在線軟件Soft Berry(http：//linux1.softberry.com/berry.html)的NSITE分析工具進行轉錄調控元件分析。

2 結果

2.1 細胞培養物ALV-p27抗原ELISA檢測 對收集的184份細胞培養物進行ALV-p27抗原檢測，結果顯示，有5份樣品為陽性，陽性率為2.71%(圖1)。

圖1 樣品ELISA檢測結果Fig.1 ELISA results of the samples

2.2 陽性樣品PCR檢測 陽性樣品進行亞群鑒定，結果表明，有4份樣品在692 bp有特異性條帶，1份樣品在545 bp處有特異性條帶(圖2)。分別與ALV-A和ALV-J鑒定引物預期片段大小一致，表明4份為ALV-A，1份為ALV-J。將鑒定出的ALV-J毒株命名為SDLYU1901。

圖2 樣品PCR檢測結果Fig.2 PCR results of the samplesM: DNA標準DL2 000； 1: 陰性對照； 2～6: 陽性樣本M: DNA marker DL2 000; 1: Negative control; 2- 6: Positive sample

2.3 ALV-J分離株全基因組序列分析 分離株的前病毒基因組全長為7 640 bp。主要結構基因gag、pol、gp85和gp37基因長度分別為2 106、2 622、921 bp和591 bp，3′UTR長度為678 bp，3′LTR長度為326 bp。SDLYU1901與J亞群參考株全基因組相似性在93.1%～96.4%，其中與分離株JS09GY3相似性最高為96.4%，與其他亞群參考株相似性為83.0%～84.4%(表2)。系統進化分析結果顯示，SDLYU1901與2009年江蘇蛋雞分離株JS09G3、JSO9GY6處于同一個分枝(圖3)。

表2 分離株SDLYU1901 相似性分析Table 2 Similarity analysis of SDLYU1901 (%)

圖3 基于SDLYU1901 全基因系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of whole genome of SDLYU1901?： 本試驗分離株; 下同?： Strain isolated in this test. The same as below

2.4 分離株env基因序列分析 ALV的env基因是病毒致腫瘤類型的關鍵基因，該基因編碼決定病毒亞群特異性的gp85 表面蛋白以及 gp37 跨膜蛋白[10]。正是env基因的差異，導致了 ALV-J的致病性、致瘤性普遍強于其他亞群病毒[11]。對沂蒙草雞分離株SDLYU1901gp85基因分析，結果顯示，gp85基因與分離株GX15MM6-2親緣關系較近(圖4A)，核苷酸相似性為95.4%，氨基酸相似性為92.8%。對SDLYU1901gp37基因分析，結果顯示，gp37基因與分離株SCDY-1親緣關系較近(圖4B)，核苷酸相似性為97.0%，氨基酸相似性為96.4%。

圖4 基于分離株SDLYU1901 gp 85基因(A)和gp 37基因(B)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of gp 85 gene (A) and gp 37 gene (B) of SDLYU1901

2.5 分離株3′UTR序列分析 3′UTR由rTM(redundant TM)、單拷貝正向重復單位(Direct repeat，DR1)和 E 元件(XSR)構成[12]。不同ALV-J毒株3′UTR 區域突變程度不同。SDLYU1901 在3′UTR缺失主要發生在rTM和DR1區域，包括rTM區域的175 bp以及DR1區域的30 bp，共有205 bp的缺失。分離株E元件未發現缺失。見圖5。

圖5 ALV-J分離株與參考毒株3′UTR基因序列分析Fig.5 Gene sequence analysis of 3′UTR of ALV-J isolated strain and references strains

2.6 分離株3′LTR序列分析 LTR序列由高度保守的R區和U5區，以及含有較多轉錄調控元件U3區構成[13]。對分離株U3區序列分析，結果顯示，其與ALV-J原型株HPRS-103相似性最高，為97.3%。對分離株SDLYU1901的U3區進行轉錄元件分析，結果顯示，其轉錄元件與原型株HPRS-103高度一致，包含有C/EBP、E2BP、NFAP-1、AIB REP1、TATA box、2個Y box、2個PRE box、2個CArG box等轉錄調控元件。見圖6。

圖6 不同ALV-J 分離株U3區對比分析Fig.6 Comparative analysis of the U3 region of different ALV-J strains

3 討論

自1999年我國首次報道從肉雞中分離到ALV-J至今20余年間，其給我國養禽業帶來巨大經濟損失[14]。2008年開始的禽白血病凈化工作取得了顯著成效[15]。然而自2018年開始，我國雞群感染禽白血病的報道明顯增多，禽白血病在我國部分地區有重新流行趨勢[2,9]。本試驗對沂蒙地區2個規模較大的沂蒙草雞養殖場開展禽白血病感染情況調查，從184份血漿樣品中分離到5份ALV陽性樣品，經過分型引物鑒定有4份樣品為ALV-A，1份樣品為ALV-J，表明沂蒙草雞雞群存在ALV感染。

對分離到的ALV-J毒株SDLYU1901進行了全基因組序列測定及分析。結果顯示，分離株與JS09GY3及JS09GY6親緣關系最近，表明它們有著共同來源。對毒株結構基因進行分析，結果顯示，gag和pol相對較為保守，與J亞群其他毒株相比，氨基酸變異頻率在5%以內，而env基因變異頻率較高。研究表明，env基因決定病毒的致瘤譜及宿主范圍，特別是gp85基因的hr1、hr2以及Vr3等區域[16]。本試驗分離毒株gp85基因與廣西三黃雞分離株GX15MM6-2親緣關系最近，gp37基因與四川分離株SCDY-1親緣關系較近，這提示分離株或許是不同宿主來源分離株的重組毒株，而這種可能的重組毒株是否會導致臨床癥狀和腫瘤變異需要進一步研究。

LTR區的 U3區含有轉錄啟動子和增強子等轉錄調控元件，與病毒毒力、轉錄水平和復制能力等密切相關[17]。本試驗分離株SDLYU1901的LTR的U3序列與原型株HPRS-103相似性最高，為97.3%，高度保守。3′UTR與ALV的表達調控，復制動力學密切相關[12]。作者前期對1988—2018年分離的85株ALV-J全基因的3′UTR序列進行分析，發現85株ALV-J分離毒株中有84.71%毒株在3′UTR區域存在1個205 bp(175 bp位于rTM，30 bp 位于DR-1)的缺失[1]，而且該缺失已經被證實有利于病毒復制，增強蛋雞和肉雞的致病性[18]。本試驗中分離株SDLYU1901在3′UTR存在一個同樣的缺失。作者前期試驗發現，在85株ALV-J中有30.59%(26/85)存在E原件缺失[1]，而這些毒株主要分離自白羽肉雞和黃羽肉雞，且2014年后分離毒株未發現該缺失繼續出現。本試驗分離株SDLYU1901的E元件也未發生缺失。

本試驗對沂蒙地區沂蒙草雞禽白血病感染情況進行調查，并對分離到的1株ALV-J完成了全基因組序列測定及分析。本試驗結果表明，沂蒙草雞存在ALV不同亞群感染，而且分離到的ALV-J毒株可能是由早些年不同宿主遺傳背景分離株重組產生的，該病毒致病性及其對本地雞群影響尚不清楚，需要進一步研究。本試驗調查結果對下一步開展禽白血病凈化工作有重要指導意義，同時探究的ALV-J 毒株來源及變異情況，對研究病毒溯源有指導意義。