丹參藥渣的功能組分及體外抗氧化活性

鄭艷萍，袁 琪，李偉東，金俊杰，李 霜

(1.江蘇海昇藥業有限公司，江蘇 南京 210061；2.南京工業大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800)

丹參(Salviamiltiorrhiza)是我國重要的傳統中藥，屬于40種常用大宗中藥材品種之一，在臨床上廣泛用于治療心腦血管疾病。我國的山東、四川、陜西和河南等省份是丹參的主產區，其中山東、四川兩省的丹參產量可達1.6萬t[1]，預計全國丹參藥材產量在2萬t左右。丹參藥材加工提取有效成分后，可產生萬噸級的丹參藥渣。近年來，針對中藥渣的開發利用研究成為熱點，包括生物煉制、食用菌栽培基質、雙向發酵以及動物飼料添加劑等應用[2]。

丹參藥材中主要含有脂溶性二萜醌類、丹參酮類和水溶性的酚酸類、黃酮類、三萜類和甾醇等成分。現代藥理研究結果表明，丹參在多方面具有較強的抗氧化活性，在治療活性氧誘發的心腦血管疾病方面具有顯著的療效[3]。因此，抗氧化活性可作為丹參藥材品質的評價方法[4-5]。我國丹參中成藥制備常采用水浸丹參,其水溶性浸出物和其他藥物混合制成丹參中成藥[6]。經水浸提加工后的丹參藥渣中，仍存在部分脂溶性的功能物質未得到充分利用，導致丹參資源性的浪費[7]。因此，對丹參藥渣開展功能組分和精深加工的研究，可以促進丹參藥材物盡其用，提升綜合經濟效益。

本文中，筆者主要對水浸提后丹參藥渣的“三大素”和丹參酮等脂溶性功能組分進行分析，考察丹參藥渣的體外抗氧化活性，為丹參藥渣的深度開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 丹參藥渣

丹參經水浸提加工后的藥渣，由江蘇海昇藥業有限公司提供，形態如圖1所示。藥渣粉碎過0.425 mm篩，烘干備用。

圖1 丹參藥渣形態Fig.1 Danshen residues after water-extracted

1.1.2 化學試劑

中藥化學對照品丹參酮I、丹參酮IIA、丹參酮IIA-磺酸鈉、隱丹參酮以及二氫丹參酮，四川維克奇生物科技有限公司。2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid，ABTS·)、1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH·)、鄰二氮菲、鐵氰化鉀等試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 丹參藥渣中纖維素、半纖維素、木質素組分檢測

采用美國國家可再生能源實驗室(NREL)方法對其處理后，用HPLC進行檢測，最后計算藥渣中纖維素、半纖維素及木質素的含量[8]。

1.2.2 丹參藥渣中可溶性還原糖和蛋白質

稱取藥渣20 g/L，121 ℃保溫20 min后抽濾，取濾液為待測樣品。采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)顯色法測濾液中還原糖含量[9]，以葡萄糖制作標準曲線。采用Brandford法測藥渣中水溶性蛋白的含量[10]，以牛血清蛋白制作標準曲線。

1.2.3 丹參藥渣中丹參酮組分檢測

藥渣處理方法參照文獻[11]，略有改動。取丹參藥渣5 g于圓底燒瓶中，加入100 mL甲醇，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，再稱定，用甲醇補足損失量，取濾液，過0.45 μm有機膜，于4 ℃避光備用。

檢測條件：色譜分離柱為 Amethyst C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，島津公司LC-20AB型高效液相色譜(HPLC)儀及紫外檢測器。檢測波長為270 nm，流動相為體積分數80%甲醇，進樣體積為10 μL，流速為1.0 mL/min，柱溫為 30 ℃。

分別精密稱取適量各種丹參酮標準品，用甲醇溶解，配制不同質量濃度5～50 mg/L的溶液，過0.45 μm有機膜避光保存備用。分別以丹參酮標準品的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作標準曲線。

1.2.4 丹參藥渣體外抗氧化活性分析

丹參藥渣水浸提物或乙醇浸提物的制備。取丹參藥渣或滅菌處理后的丹參藥渣(含水量65%，經121 ℃滅菌處理1 h)的樣品，按干物質與所加蒸餾水或75%乙醇的質量比為1∶ 10來配料，稱定質量， 60 ℃超聲提取2 h后冷卻，再稱定質量，用蒸餾水或75%乙醇補足損失量，抽取濾液，過0.45 μm有機膜，于4 ℃避光備用。對水或醇提取物用蒸餾水進行體積比1∶ 20稀釋后，進行抗氧化活性分析。

ABTS+·的清除。用蒸餾水配制含7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L過硫酸鉀的混合溶液，將溶液放置于25 ℃避光孵育12～16 h得ABTS+·溶液。使用時用蒸餾水將該溶液稀釋至其在波長 734 nm處吸光度為 0.700±0.005，即得ABTS+·工作液。測量時取 0.1 mL受試物溶液，加入 3.9 mL ABTS+·工作液，混合搖勻后于25 ℃孵育6 min，測量其在波長 734 nm 處的吸光值，并計算清除率(以純溶劑做空白對照)。

ABTS+·清除率=

(1-實驗組吸光值/空白組吸光值)×100%

(1)

DPPH·的清除。將0.1 mmol/L的DPPH 溶于乙醇溶液，即為DPPH·溶液。測量時取 2.0 mL 受試物溶液，加入2.0 mL DPPH·溶液混合搖勻，于25 ℃避光孵育 30 min，測其在波長517 nm 處的吸光值，并計算清除率(以95%乙醇做空白對照)。

DPPH·清除率=

(1-實驗組吸光值/空白組吸光值)×100%

(2)

總還原能力的測定。測量時取 2.5 mL 受試品溶液，加入 2.5 mL 磷酸緩沖液(0.2 mmol/L，pH 6.6)和 2.5 mL 1%(質量分數)鐵氰化鉀溶液混勻，置于50 ℃孵育 20 min，迅速冷卻，迅速加入 2.5 mL 10%(質量分數)三氯乙酸溶液并混勻，在3 000 r/min下離心 10 min，取2.5 mL上清溶液，再加入 2.5 mL 純水和 0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻后測定其在波長700 nm 處的吸光值。吸光值越大，表示受試物的還原能力越強。

·OH的生成及清除。在 10 mL 試管中依次加入 1.5 mL 5 mmol/L的鄰二氮菲溶液、3 mL 0.5 mol/L pH7.4 的磷酸緩沖液、1 mL 7.5 mmol/L的FeSO4后立即搖勻，迅速加入待測溶液 3 mL，1 mL 0.1%(質量分數)的H2O2，然后用蒸餾水將反應體系體積補充至10 mL，迅速搖勻，然后將混合溶液于37 ℃水浴鍋保溫60 min，測量其在波長510 nm處的吸光值。

·OH清除率(E)=(AS-A0)/(A1-A0)×100%

(3)

式中：AS為含樣品及H2O2的反應體系吸光值，A1為蒸餾水代替樣品及H2O2的反應體系吸光值，A0為蒸餾水代替樣品的反應體系吸光值。

2 結果與討論

2.1 丹參藥渣中的“三大素”及可溶性還原糖、蛋白質組分

植物源的藥渣中含有豐富的纖維素、半纖維素、木質素、多糖、蛋白和多種微量元素。丹參藥渣體量達萬噸級，深入分析藥渣組分中的纖維素、半纖維素和木質素等組分含量，有助于從生物煉制角度去探討藥渣的利用潛力。

采用美國國家可再生能源實驗室(NREL)方法對丹參藥渣的“三大素”組分進行了分析，并對藥渣的可溶性還原糖和蛋白質進行了檢測，結果如表1所示。由表1可知：丹參藥渣中可溶性還原糖和蛋白質含量較低，難以作為微生物代謝的速效碳源或氮源。丹參藥渣中的纖維素、半纖維素和木質素的占比分別為19.5%、20.8%和16.8%。值得關注的是，丹參藥渣中的纖維素含量比玉米秸稈中的(37.3%)[12]顯著偏低，使得通過纖維素酶解丹參藥渣制備可發酵糖的可行性存在較大局限。半纖維素和木質素等組分可以較好地被白腐真菌利用[13]。因此，丹參藥渣可用于白腐真菌的培養基質。

表1 丹參藥渣的“三大素”及可溶性還原糖、蛋白質含量

2.2 丹參藥渣中的丹參酮組分檢測

丹參酮是丹參中的脂溶性松香烷型二萜類化合物，又稱為總丹參酮，是丹參根部的主要提取物之一，具有廣泛的藥理作用，受到醫藥學家的高度關注[14]。采用水浸提工藝對丹參藥材進行加工后，脂溶性的丹參酮組分仍殘留在藥渣中，并未得到充分利用。

5種丹參酮組分標準品的混合物HPLC圖譜如圖2所示，丹參藥渣經醇提后的提取物HPLC檢測圖譜如圖3所示。根據圖2和圖3計算各組分峰面積對應的含量，測得丹參藥渣中的丹參酮各組分：二氫丹參酮0.47 mg/g、隱丹參酮0.61 mg/g、丹參酮I 1.44 mg/g、丹參酮IIA 2.38 mg/g、總丹參酮含量為4.90 mg/g。

圖2 丹參酮混合標準品的HPLC圖譜Fig.2 HPLC profile of tanshinone mixed standard

圖3 丹參藥渣乙醇提取物的HPLC圖譜Fig.3 HPLC profile of ethanol extract from Danshen residue

丹參藥材中丹參酮的含量除受到樣品處理方式及檢測精度影響外，還受到藥材加工方式、藥材品種來源及產地等影響。整理部分文獻數據，各種丹參樣品以及丹參藥渣中丹參酮含量如表2所示。藍天鳳等[15]對10個藥店的丹參藥材取樣分析了丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮和二氫丹參酮的含量，丹參酮量為2.89～7.80 mg(以1 g藥渣計)。夏靜等[16]分析了不同來源丹參品種在同一環境條件下栽培后的樣品中丹參酮含量，對丹參酮IIA、丹參酮I、隱丹參酮進行了分析，總丹參酮含量為5.42～9.77 mg。戴新新等[7]檢測了山東菏澤步長制藥有限公司提供的丹參藥渣固體廢棄物中丹參酮的質量，其丹參酮總量為5.12 mg。本研究中，丹參藥渣樣品中的總丹參酮的質量為4.90 mg(以1 g藥渣計)，與戴新新等[7]研究的結果相近。通過文獻數據比較可知，丹參藥渣中丹參酮組分主要為丹參酮IIA、丹參酮I和隱丹參酮，與丹參藥材中的組分一致，且質量接近5 mg。綜上，丹參藥渣可作為一種丹參酮資源，具有進一步開發利用的價值。

表2 丹參藥材及丹參藥渣中的丹參酮含量

2.3 丹參藥渣的體外抗氧化活性

丹參的抗氧化活性是丹參藥材品質、藥品質量等的重點參考因素。已有研究表明，丹參水溶性成分具有顯著的抗氧化活性，也是丹參及其制劑治療心腦血管疾病的作用基礎[17]。水浸提后丹參藥渣中仍殘余相當可觀的丹參酮等脂溶性功效組分，對丹參藥渣的體外抗氧化活性研究有助于其應用開發。

李鵬等[18]研究了天士力集團復方丹參提取剩余物(丹參復方藥渣)的水/醇提取物混合物的體外抗氧化活性，結果表明丹參藥渣具有一定的體外抗氧化活性，為將其開發成動物抗氧化飼料保健品提供了理論依據。

以ABTS·清除、DPPH·清除、總還原能力測定以及·OH清除等為評價方法，將丹參藥渣的水提取液和醇提取液分別進行了體外抗氧化活性研究，結果如表3所示。由表3可知，丹參藥渣的乙醇提取物較水提取物具有更好的抗氧化活性。尤其值得關注的是，對丹參藥渣進行高溫(121 ℃)處理1 h后，水/醇提取物的抗氧化活性均顯著降低。這一結果有兩個方面的指導作用：一是丹參中的抗氧化活性物質不耐受高溫，在提取處理過程中有必要關注高溫對抗氧化活性物質的降效作用；二是以丹參藥渣為培養基質進行“雙向發酵”時，高溫滅菌處理藥渣后，菌質的抗氧化活性會有較大損失。

表3 丹參藥渣水/醇提取物的體外抗氧化活性

3 結論

通過對水浸提加工后的丹參藥渣進行組分分析和體外抗氧化活性研究，結論如下：①丹參藥渣中木質素含量較高，可溶性還原糖及蛋白質含量低，適合做白腐真菌培養基質；②1 g丹參藥渣中丹參酮總量達4.90 mg，可作為丹參酮資源；③丹參藥渣的乙醇浸提物具有較好的抗氧化活性。