重組白細胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白工程菌的高密度發酵

冀成法，馬魯南，柳常青，滕學東，邵明學，劉 忠，張貴民

(1.魯南制藥集團股份有限公司 哺乳動物細胞高效表達國家工程實驗室，山東 臨沂 276006；2.魯南新時代生物技術有限公司，山東 臨沂 273400；3.山東新時代藥業有限公司 山東省蛋白類藥物工程實驗室，山東 臨沂 273400)

腦卒中又叫腦中風，是由各種不同病因引起的腦部血管性疾病，是我國成年人致死、致殘的首位病因，具有發病率高、致殘率高、死亡率高和復發率高的特點，是導致老年人死亡的最常見三大疾病(腦血管病、冠心病、腫瘤)之一。數據顯示，2017年我國約有 196 萬人死于腦卒中[1]。重組白細胞抑制因子和水蛭肽嵌合蛋白(TNHH)是應用基因工程技術設計的一種新型蛋白藥物，屬于治療用生物制品Ⅰ類新藥。該蛋白具有多重功效，包括抑制白細胞活化、遷移、黏附功能，抑制凝血酶活性，能與纖維蛋白結合，從而達到治療腦卒中的目的[2]。TNHH由280個氨基酸組成，N末端含257個氨基酸的NIF，C末端含20肽水蛭肽(hirulog)，中間由短鏈氨基酸交鏈區組成，TNHH結構中，NIF區域與天然的NIF差異1個氨基酸，而其中水蛭肽與文獻[3]報道的hirulog有2個氨基酸差異。

重組大腸桿菌的生長受培養基和培養條件的影響，其中影響較大的有培養基組成、pH、培養溫度、誘導劑濃度和補料方式等[4-7]。根據TNHH工程菌的生長特性，結合包涵體產量，優化培養基組成及補料流加方式，以減少碳源的抑制[8-9]，控制合適的比生長速率，選擇在適宜的密度誘導表達，實現TNHH工程菌的高密度高表達。鑒于誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)毒性較大、成本較高，而乳糖作為二糖，無毒、價廉，本身可以作為碳源使用，是一種較佳的IPTG替代物，目前已有不少基因工程菌利用乳糖進行誘導的報道[10-11]，筆者對此進行了對比研究。隨著國家藥品監督管理局對制藥行業抗生素使用的監管趨嚴，《中國藥典》明確規定青霉素類抗生素禁止在生產過程中使用。為此，本研究還考察了工藝放大過程中抗生素對發酵結果的影響。

1 材料和方法

1.1 菌株

TNHH表達菌株E．coliBL21(DE3)/pET12a-TNHH，由本實驗室構建(質粒構建見圖 1)和保存。

圖1 表達重組質粒pET12a-TNHH的構建Fig.1 Construction of recombinant plasmid pET12a-TNHH

1.2 培養基

LB培養基：配方參照文獻[12]。

LA培養基：在LB培養基中加入氨芐西林鈉(Amp)溶液。

發酵培養基(M9-YE-Gly)：0.3%酵母膏、0.5%蛋白胨、0.06%NaCl、0.5%KH2PO4、3%Na2HPO4·12H2O、2%甘油、0.1%MgSO4、0.3%NH4Cl。

補料：50%甘油、5%蛋白胨、3%酵母膏。

以上都是質量分數。

所有培養基均用氨水調節pH到7.0，各培養基均加入氨芐西林鈉溶液至0.1 g/L。

1.3 儀器設備

5 L多聯玻璃發酵罐、50 L發酵罐，迪必爾生物工程(上海)有限公司；LYNX 6000型高速冷凍離心機，Thermo公司；DM750型顯微鏡，徠卡公司；Ultrospec 2100 pro型紫外分光光度計，GE公司。

1.4 方法

1.4.1 種子培養

甘油管菌種劃線接種至固體LB斜面上，37.0 ℃培養12～15 h，挑取種子斜面菌落接種于液體LB培養基中，37.0 ℃、150 r/min培養至OD600為 0.5～0.8，得活化種子液。

1.4.2 搖瓶培養

將培養好的活化種子液按1%接種量接入含200 mL M9-YE-Gly培養基的三角瓶中，37 ℃、200 r/min培養12～15 h。

表1 培養基的正交試驗設計及結果

1.4.3 分批補料發酵

發酵采用5 L和50 L發酵罐，初始發酵體積為發酵罐體積的60%，按發酵初始體積的10%接種量接入搖瓶種子液，發酵溫度為37 ℃。整個發酵過程通過調節攪拌轉速或通入純氧控制溶氧在30%～60%。當培養基中養料耗盡，溶氧和pH同步上升后，采用指數流加的方式補料。待OD600達到40，加入適當濃度的誘導劑進行誘導，根據試驗設計繼續補料培養。

1.5 分析方法

1.5.1 菌體密度測定

采用紫外分光光度計測定600 nm波長處的光密度，用OD600表示。

1.5.2 TNHH蛋白表達量的測定

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDS-PAGE)參照文獻[13]，采用凝膠處理系統分析目的蛋白表達量。

1.5.3 質粒丟失率檢測

TNHH工程菌的表達質粒帶有氨芐抗性基因，在菌體傳代過程中，在一定濃度的抗生素環境下，質粒丟失后菌體便不能存活，而在不含抗生素的發酵培養液中，隨著傳代代次的提高，可能有部分大腸桿菌丟失了質粒，失去了抗生素抗性基因，也同時失去表達目的蛋白的能力。通過比較在含有或不含抗生素培養基的菌體存活數，可以檢測質粒的丟失率，考察發酵過程的質粒穩定性。

發酵過程取樣，測定菌體密度，取適當稀釋倍數的菌液涂布于不含氨芐西林鈉的LB平板上，37 ℃培養16 h，用無菌牙簽隨機挑取100個單菌落分別接種于含氨芐西林鈉的LA平板和LB平板上， 37 ℃培養15 h。統計2種平板長出的菌落數目，按式(1)計算。

(1)

2 結果與討論

2.1 搖瓶發酵結果

2.1.1 正交試驗優化培養基組分

通過田口試驗設計方法重點考察合成培養基中碳、氮源不同的濃度水平，進行酵母膏(Y)、蛋白胨(T)、NH4Cl(N)、甘油(G)四因素三水平試驗(表1)，圖2所示為9組試驗搖瓶的SDS-PAGE電泳表達情況，TNHH理論分子量3.1×104～3.5×104，箭頭所指示的條帶即為目的表達條帶。經Minitab軟件分析，確定了最佳的發酵培養基組成Y2T2N3G1，提高并穩定外源蛋白的表達量在30%以上。

M—標準蛋白; 1～9—9組搖瓶試驗的TNHH圖2 培養基組分優化的SDS-PAGE分析電泳表達圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of the optimization results of culture medium

2.1.2 溫度對工程菌生長的影響

選擇不同培養溫度(30、35、37、39、42和45 ℃)條件下，150 r/min培養4 h后，加入IPTG誘導表達，結果如圖3所示。由圖3可知：在30 ℃時，工程菌的生長速度顯著慢于其他溫度，在接種后6 h生長速度隨著溫度的升高逐步加快，6 h以后工程菌生長速度趨于一致。在45 ℃培養6 h后工程菌生長速度開始減慢，同時在45 ℃培養14 h后生長速度也有下降趨勢，推斷高溫使工程菌代謝負荷加重，影響胞內酶系統的正常運轉，從而使工程菌過早老化所致。由此可知，35～39 ℃是工程菌生長的最適溫度，是比生長速率達到最大值的溫度范圍。

圖3 溫度對工程菌生長的影響Fig.3 Effects of temperatures on cell growth

2.1.3 pH對工程菌生長的影響

調節培養基pH為6.0、6.5、6.8、7.0、7.2、7.5、8.0，37 ℃、150 r/min培養4 h后，加入IPTG誘導表達，發酵過程取樣測OD600，結果如圖4所示。由圖4可知：不同pH條件下，菌體生長的延遲期均在3 h左右，其中，pH為6.8～7.5時，菌體對數生長期持續到6～7 h。在對數生長期內，工程菌在pH6.0時生長速度最慢，其次是pH8.0、7.5和6.5；而pH為6.8～7.5時，在7 h內的菌體生長速度基本相同，在7 h后隨著pH的升高，生長速度呈同步上升趨勢。由于工程菌在生長過程中會產生代謝副產物(如乙酸、乳酸等)，搖瓶培養無法調控pH，這使培養基的pH不斷下降，而pH為7.5時，工程菌在7 h后仍能保持較快的生長速度。由此可知，過低的pH(pH6.5以下)和過高的pH(pH7.5以上)都會抑制工程菌的生長，工程菌的最適生長pH為6.8～7.5。

圖4 pH對工程菌生長的影響Fig.4 Effects of pH on cell growth

2.1.4 誘導劑濃度和誘導時間對工程菌生長和目的蛋白表達的影響

搖瓶培養5 h后，分別加入終濃度為0.1、0.2、0.4和1.0 mmol/L的IPTG，0.1、0.5和1.0 g/L乳糖誘導10 h，發酵結束取樣測蛋白表達量，結果如表2和圖5所示。由表2和圖5可知：不同IPTG濃度對表達量影響不大，而不同乳糖濃度對表達量有一定影響，IPTG的誘導表達效果優于乳糖。加入IPTG和乳糖都會對工程菌的生長有顯著抑制，但乳糖的抑制作用弱于IPTG，這可能與IPTG的毒性有關。綜合考慮成本及高密度發酵，優選0.2～0.4 mmol/L IPTG為誘導劑。乳糖雖然搖瓶試驗誘導效果不及IPTG，但1.0 g/L乳糖誘導的表達量仍能達到25.6%，其無毒、價格低廉，可以考慮在發酵罐放大階段進一步優化以替代IPTG作為誘導劑。

表2 不同誘導劑濃度對工程菌發酵影響實驗數據

圖5 誘導劑濃度與誘導時間對工程菌生長影響Fig.5 Effects of inducer concentration and induction time on cell growth

2.2 發酵罐結果

大腸桿菌高密度發酵最大的難題和障礙是乙酸的生成[14-15]，基于此，在不同的時間流加同等量的補料以保證菌體正常生長，可一定程度上降低乙酸的生成。誘導劑的加入會顯著抑制工程菌的生長，如果在較低的菌體密度下誘導，會導致最終發酵密度偏低，就無法實現高密度發酵，而在過高的菌體密度下進行誘導，可能會導致誘導后期菌體自溶或表達量偏低。因此，發酵誘導時機也是高密度發酵需要考慮的重要因素。由于TNHH工程菌具有氨芐抗性，在發酵過程中添加Amp能有效抑制質粒丟失工程菌的生長，在一定程度上提高發酵表達量，但《中國藥典》明確規定青霉素類抗生素禁止在生產過程中使用，因此應考察非抗生素選擇壓力下發酵過程的質粒丟失情況，以保證生產過程的穩定。

2.2.1 5 L發酵罐發酵

在搖瓶試驗結果的基礎上，在5 L發酵罐中采用分批補料的方式發酵生產TNHH融合蛋白。以改良培養基為發酵基礎培養基，接種量5%～10%，控制溫度37 ℃，溶氧不低于30%。優化補料量和補料時間，待培養基主要碳源基本耗盡，加入IPTG誘導，誘導后補料時間控制在4、6和8 h，過程中取樣檢測菌體密度和表達量，發酵結果如圖6和7所示。由圖6和7可知：隨著補料時間的延長，OD600從36.34提高至62.30；包涵體質量從7.3 g提高至18.8 g，提高了258%。隨著補料時間的進一步延長，目的蛋白表達量均同步增加，可見增加補料量并延長誘導時間均有利于菌體密度的提高和目的表達產物的積累。

圖6 補料量和補料時間對工程菌OD600的影響Fig.6 Effects of feed quantity and feed time on OD600

圖7 補料量和補料時間對工程菌發酵的影響Fig.7 Effects of feed quantity and feed time on fermentation

2.2.2 50 L發酵罐中試發酵

基于以上試驗結果，筆者確定了50 L發酵罐中試發酵方案：采用半合成培養基，溶氧30%左右，pH6.8～7.5，接種后37 ℃培養6～8 h，待養料耗盡，恒速流加補料1～2 h，待培養基主要碳源基本耗盡，加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG誘導，繼續指數流加補料誘導培養8 h，結果如表3所示。由表3可知：發酵的前一階段，工程菌的生長速率很高，但隨后工程菌生長趨于緩慢；工程菌最終的OD600在79以上，表達量維持在30%以上，質粒丟失率保持在10%以內。

表3 50 L發酵罐結果

3 結論

為實現TNHH的高密度發酵和高效表達，首先利用搖瓶試驗對單因素逐一優化，隨后優化補料流加策略，通過5 L發酵罐試驗確定了最適宜的培養基配比、培養溫度35～39 ℃、pH 6.8～7.5、誘導劑濃度0.2～0.4 mmol/L IPTG，通過優化后的培養基及發酵工藝進行50 L發酵放大，符合預期。通過搖瓶試驗對比了IPTG和乳糖對發酵誘導的影響，乳糖效果不及IPTG，但其價廉、無毒，仍可以作為一種備選的誘導劑。通過不同的補料時間流加等量的補料，獲得了相對較佳的補料速度和誘導時間，控制工程菌的比生長速率，從而實現菌體密度的提高和目的表達產物的積累。

采用構建的TNHH中試發酵工藝，在50 L發酵罐中發酵6批，無論是否添加抗生素，各批發酵結果的穩定性和重復性較好，最終菌體密度OD600均能達到79以上，目的蛋白表達量30%以上，發酵結束時的質粒丟失率保持在10%以內。通過一系列的發酵參數及補料控制等過程優化，摸索出了較佳的發酵培養基和工藝控制策略，發酵產量提高258%，在獲得TNHH高產的同時保證了較低的質粒丟失率。本研究為該項目后續GMP生產的工藝控制與偏差管理提供了理論與技術支持，并對TNHH的商業化發酵生產及推廣具有重要的技術指導意義。