熒光激活細胞分選技術加速酶定向進化

朱潤濤，高浩峰，楊一帆，劉永琪，李佳祺，張 霞，胡 南

(南京工業大學 生物與制藥工程學院，江蘇 南京 211800)

酶是具有高催化效率、專一性的有機大分子，它在生物催化、高分子合成和醫藥開發等領域有著廣泛應用[1]。成功的生物催化反應取決于具有優良特性的酶。雖然天然酶可以通過發掘基因組數據庫、篩選宏基因組文庫獲得[2-3]，但是天然酶難以滿足工業應用的需求。因此，在未來酶工業化應用中，需要對酶的催化特性進行改造以滿足應用的需求[4]。

分子定向進化是設計工業酶的一種強大、快速且可靠的方法。2018年諾貝爾化學獎授予了定向進化先驅——美國科學家Frances H.Arnold女士，這一獎項肯定了蛋白質定向進化作為工業領域標準化的通用工具及自它誕生之后帶來的廣泛社會效益。定向進化通過改造天然酶，獲得一系列具有強催化活性[5]、底物選擇性[6]和立體選擇性[7]等優良特性的突變體，這些優勢可以應用于化學原料藥與醫藥中間體的綠色合成等。更重要的是，定向進化推動了人類由化石能源時代向可循環生物經濟時代邁進[8]。

定向進化技術是在基因水平上通過多輪突變，構建高通量突變文庫，然后在蛋白質水平，利用高通量篩選技術，獲得高活性突變體的一種技術(圖1)。但是，建立高效、成熟的高通量篩選方法是酶定向進化的瓶頸之一。最簡單的篩選方法是平板篩選法(包括凝膠平板篩選和微量平板篩選法)，還可通過色譜法、光譜法或質譜法篩選突變體表型。人工篩選速率為103個/天，自動化篩選速率可以增加到105個/天[9]。毛細管電泳法在理論上是最簡單的方法，但篩選速率不超過106個/天[10]。這些方法通常耗時且費力，無法達到高通量篩選的要求[11]。

圖1 酶定向進化的基本方法Fig.1 Principles of directed evolution

熒光激活細胞分選技術(FACS)將表型與熒光信號耦聯實現高通量篩選,設備由3個獨立的組件構成(圖2)：先采用區室化技術將基因型(例如，攜帶突變體DNA的宿主)與光學可檢測的酶(例如熒光產物)在空間上分離，再測定反應室的光學信號，最后分離和篩選突變體。

圖2 高通量篩選表型與基因型相耦聯的微反應體系Fig.2 High-through screening genotype-phenotype coupling micro-reactions

Dittrich等[12]首先發明現代流式細胞儀,它能夠分析細胞以及人造小體(如液滴和微球)的散射和多色熒光信號，或測定油滴的大小和熒光強弱[13]。本文中，筆者從基因型與表型的耦聯方式對熒光激活細胞分選技術進行分類，以篩選速率和耦聯相關性為主要依據，分析多種分隔技術的優缺點。

1 細胞展示高通量篩選技術

細胞可用作酶的天然反應容器，將突變體基因型與表型耦聯。在定向進化進程中，熒光激活細胞分選技術能實現突變體的篩選和分離。因此，以細胞作為可測區室，具有廣泛的通用性和高效性，但是難點在于如何將基因型與表型和胞內外熒光信號相耦聯。

最直接的解決方法是使用天然存在于細胞內的生物大分子，以周質空間作為生物反應器，將蛋白的特異與熒光蛋白熒光強度相耦聯。Santoro等[14]已經成功地使得改造過的DNA重組酶能夠識別新的loxP突變位點。Wang等[15]將底物與綠色熒光蛋白(GFP)耦聯，使得蛋白伴侶增加了折疊腔極性的同時，改變了腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)酶循環。Peck等[16]發現，小分子物質4-羥基三苯氧胺(4-HT)能夠加速GFP標記的內含肽剪切分裂，細胞內內含肽的剪切活性升高，最終使得內含肽的剪切效率提升了2～8倍。Hess等[17]將GFP標記的小向導RNA(sgRNA)與細胞內的靶標結合，進而通過FACS快速分離，結果擴大核酸內切酶(dCas9)的PAM識別序列。Mo等[18]利用分割型GFP(split-GFP)提升耐熱脂酶的催化活性與可溶表達能力，而與完整型GFP相比，背景熒光強度與假陽性率更低，熒光強度與可溶性和酶的催化能力相關性更強。

如果熒光底物難以穿透細胞，無法使得酶活性與胞內熒光相耦聯達到檢測篩選的目的，這時可以通過使用外部熒光底物來改造不能攜帶熒光信號的突變型。如,在利用大腸桿菌改造糖基轉移酶時，熒光標記的糖底物通過轉運蛋白進入細胞，隨后，酶切割使熒光產物不能離開細胞，從而分離熒光細胞，同時也可以使熒光底物與突變體活性耦聯，從而將熒光物質包裹在細胞表面從而完成篩選[19]。Schwaneberg研究團隊的Ruff等[20]利用細胞色素P450單加氧酶能夠將帶有熒光特性的底物7-苯甲酰氧基-3-羧基苯丙胺乙酯分解為非熒光的7-羥基-3-羧基苯丙胺乙酯，從而篩選出活性的P450單加氧酶突變體，其活性比野生型提升了7倍。

在細胞表面展示技術中，為了維持基因型-表型連鎖，可以將酶活性產生的熒光信號展示在細胞或小體表面。在細胞(或小體表面)上,底物與溶液中的熒光底物共存于反應液中，在胞內酶的作用下，酶的熒光底物與膜表面熒光底物結合，通過檢測與酶活性呈正相關性的胞內雙熒光信號，進而篩選出不同活性的突變體。例如，Lipov?ek等[21]利用酵母細胞展示技術將辣根過氧化物酶表達在酵母細胞表面，進而與熒光標記的底物結合，使得FACS能夠快速分選攜帶有熒光標記的活性突變體。或者,將突變體表達在酵母表面，進而使棕色底物(水楊羥肟酸)與目標蛋白質結合，利用FACS快速分選突變體[22]。Chen等[23]利用酵母細胞表面展示技術，并結合酶介導的生物共軛作用，快速篩選得到活性提升了140倍的共軛雙選酶A。

像蛋白酶這一類能夠破壞特殊功能鍵的酶，也可以采用表面展示技術來篩選。比如，使底物與熒光共振能量轉移(FRET)探針結合，使得在酶處理后探針活性喪失進而篩選出活性突變體；也可以改造功能鍵合成的相關酶。Dorr等[24]利用表達在宿主表面的金黃色葡萄球菌分選酶A(SerA)能夠轉移熒光底物于表達細胞表面的特性，通過9輪FACS篩選獲得活性提升51 000倍的SerA突變體。Yi等[25]通過細胞內表達蛋白酶突變體，將含有特異性切割位點的多標簽融合蛋白分段切割，隨后轉運至細胞表面，將識別不同標簽的熒光抗體與表面展示融合蛋白的大腸桿菌孵育，利FACS對細胞進行分選，最終使得蛋白水解酶(TEV-P)對不同切割位點的活性分別提高了5 000和1 100倍。此方法通過將產物轉運至細胞表面，從而解決了細胞外部展示的突變表型與細胞內部基因型難以耦聯的難題。

雖然細胞展示技術有許多成功的案例，但是依然存在許多問題。全細胞表達的優勢在于能夠以最小的代價表達出活性蛋白突變體，同時異源表達的宿主選擇也較為豐富，常見的有大腸桿菌和酵母等。但是用全細胞展示技術表達的蛋白質或者多肽的活性，與其游離態相比，仍然會造成目標物部分或全部活性的喪失[26-28]。因此，FACS可以用來改造在細胞展示技術中有活性的天然酶及突變體，但是依賴于宿主本身的表達特性。若蛋白無法有效進行大腸桿菌展示，可以選用釀酒酵母等系統進行展示和改造[29]。所以，改造不同的蛋白質需要選擇合適的表達宿主。

2 液滴微流控高通量篩選技術

若以細胞為區室，則會嚴重限制改造酶的類型，為了克服限制，Agresti等[30]在熒光激活細胞技術基礎上發展出以液滴微流控位為代表的胞外隔室技術，使突變體表型與DNA或細胞的基因型在空間上分離。微流體在通道的尺寸和流速控制下每秒產生數千個液滴(表1)，其體積為10-12～10-9L，每個液滴(包含單個突變體)構成獨立微反應器。在介電電泳作用下，熒光液滴被微流體篩選系統分選到收集室或廢棄室，其篩選效果達到109個/天。Duarte等[31]通過低溫冷凍，將含有綠色熒光突變體的表達細胞包裹于單乳相(油包水)的液滴之內，經FACS分選出不同熒光強度的突變體。Griffiths等[32]使用“水/油/水”雙乳液滴作為區室，使用FACS快速分選，最終使得磷酸三酯酶活性提高63倍。

表1 液滴微流控篩選的參數

體外區室化篩選的優勢在于液滴與突變體表型相容，適用于改造難以利用細胞對基因型與表型相耦聯的工程體。若在液滴內應用無細胞蛋白質合成系統，可用來表達對細胞有毒性的酶，也可通過裂解細胞或液滴實現細胞表達產物溢出。正是因為這種靈活性，通過液滴技術改造的酶幾年來發展較快[33]。例如，Ma等[34]利用雙通道微流體技術形成油包水單乳相，使用FACS分選攜帶酯酶編碼基因的大腸桿菌，最終使得酯酶的對映體選擇性提高700倍。Ma等[35]利用水-油-水的雙乳相結構和液滴內的活性突變體能夠將熒光分子和底物復合體水解出熒光分子的特性，將熒光物質束在液滴內部，而含有活性突變體的液滴被FACS分離。

體外隔室技術需對液滴內的酶進行多步預處理，或將反應液注射，或合并入新液滴。同樣的液滴可在擴增儀中反復加熱，或在培養細胞的芯片或不同微流體之間多次注射，也可將液滴分開、凍融、配對和破碎。使用多步液滴方法來解除耦聯，從而達到互不相容的體外翻譯和酶活性測定的目的。如，Gielen等[36]研究發現，在油包水的單乳液中，通過破碎液滴內部突變體，利用液滴微流控技術快速篩選苯丙氨酸脫氫酶，進而得到酶活性提升4.8倍的突變體。

實際上，液滴是兼具通用性和靈活性的微反應器，并可用于復雜酶的測定。雖然它可以集成復雜光學器件和電子器件達到測定復雜酶的目的，但是實際的應用成本較高。為了克服這種高成本之類的限制，Love等[37]開發了一種傳統FACS與儀器兼容的雙乳液,將該乳液用于改造磷酸三酯酶，經過多輪篩選，得到磷酸三酯酶活性提升63倍的突變體。

雖然雙重乳液可以順利進入液滴網格，但不如單乳液堅固，需要平衡相關參數(表面化學黏度、流速等)才能產生均勻分散的液滴。即便如此，在高通量篩選期間，液滴形態仍然有可能被力學作用力破壞[5]。Fischlechner等[38]開發了一種利用聚合物凝膠-殼珠復合物達到FACS高效篩選單乳液的方法，在該方法中，聚電解質殼包圍隔室由瓊脂糖核心構成，用于捕獲瓊脂糖核心活性生物大分子，篩選速率為108個/天，提升20倍酶活性。

3 微室高通量篩選技術

微室是基于微小空間對基因型-表型連鎖的突變體進行人工定向進化的反應器。目前，微室反應器主要包括兩大類：96(或386)深孔板和毛細孔板。

深孔板主要由上面開口和底部封閉的柱體構成，柱體材質為玻璃、石英或有機高聚物等。深孔板能夠在蛋白質水平對突變體進行改造[39]、篩選[40]和單分子檢測與分析[41]。基于96孔板的高通量篩選技術是使用較多、應用較為廣泛的篩選技術，主要通過直接檢測與酶活性相關的熒光產物或者熒光底物的變化達到測定突變體的生理生化特性的目的。Heinisch等[42]利用大腸桿菌表面展示技術將烯丙基脫醛酶表達在細胞表面，使突變體蛋白與孔板內部熒光底物結合，多次洗脫后，進而分選得到高活性突變體。Lee等[43]在改造脂肪酶的過程中，通過水解二氫氰酸熒光素釋放熒光素來快速篩選具有生物活性的脂肪酶。

毛細孔板主要由玻璃材質構成，平板包含了數百萬個微小、具有高長徑比的微米級的毛細管，而這些毛細管僅能夠容納單細胞或者單個微粒。在基于微毛細管的高通量篩選法中，Chen等[44]通過測定去磷酸化的熒光產物的變化來表征堿性磷酸酶的活性和底物特異性，該方法能夠將微毛細管內容物在空間上快速分離，并在單細胞水平操縱提取物，達到快速篩選的目的。

微室篩選方法的優勢在于，通過微量底物消耗，能夠高通量篩選大量突變體，并通過測定微室中熒光信號的變化準確地測定酶學性質。在選取活性突變體之前，毛細孔板法和深孔板法能夠利用熒光顯微鏡高通量地多點記錄、篩選、測定和分析熒光變化。兩種方法需要確保在微室中所包含的顆粒或者單細胞不超過1個，而其中濃度的計算需要依靠泊松分布[44-45]。隨著新技術的發展，Chen等[44]將微室技術用來分析突變體酶活性，高通量篩選突變體庫。因此，微室法在未來應用的主要障礙在于如何精確地向孔板內部添加試劑和單菌落，利用自動化的方法避免人工操作的錯誤[46]。同樣,也利用無菌空氣[47]、光鉗[48]或光鑷清空孔中的反應液。

4 篩選技術比較

雖然傳統的微孔板篩選策略仍然是酶工程領域應用的主力，但已經出現了在更高通量下進行定向酶進化的新方法，并且已經證明了它們的高效性。高通量篩選技術進步，可以使我們通過更快的速度、更少的工作量和更有效的工作流程，加速酶的定向改造。因此，這些技術可以在更短的時間內更深入地探索酶的結構與功能的關系。因此，評估高通量篩選技術優劣時，必須考慮每種方法的優點和局限性(表2)。細胞區室技術的主要優點是使用細胞的天然組分去實現突變體的篩選，而用流式細胞儀篩選加速了篩選過程，可以容易地篩選和分離107級的文庫。然而，胞內篩選依賴于底物進入細胞內部的方式，同時，細胞展示技術依靠酶在細胞(熒光底物或產物)上基因型與表型耦聯的效果。相比之下，體外區室技術能夠使酶的表達更加靈活，且可以精確控制反應物，從而實現最佳的篩選效果。但液滴的形成及其穩定性會受篩選體系中操作壓力、表面張力和流速等因素影響較大，過強的外界壓力致使液滴破碎，無法形成穩定的篩選小體。而細胞區室則會受到細胞本身條件的限制，如極端溫度、壓力和pH對細胞生長表達的限制。目前開發的玻璃或聚合物隔室會更加具有剛性和穩定性，但在篩選初期，微孔或微陣列難以控制孔徑內部的反應物質滴加與清除，影響到高通量篩選中對反應現象的精確測定。因此，在實際應用中，應根據實際需要和每種篩選方法的優缺點選取最佳的高通量篩選體系。

表2 不同區室分隔技術的優劣

與此同時，熒光激活細胞篩選技術不僅僅局限于以上3種類型，也有基于顆粒的熒光激活細胞篩選技術，如Gotrik等[57]利用RNA適配體與非熒光染料結合后會產生強烈熒光信號的特性，首先將突變體RNA適配體和RNA固定化，然后與非熒光染料混育結合，最后FACS篩選出有較強親和能力的RNA適配體的突變體。

5 結論與展望

高通量篩選技術是定向進化的瓶頸技術之一。目前，尚未出現一種能夠應用于所有突變體基因型和表型的通用性篩選技術。因此，定向改造目標蛋白仍然需要針對不同酶、不同底物和不同反應類型進行設計。熒光激活細胞分選技術是近年來國內外發展較快的高通量篩選技術，其在藥物篩選、代謝工程和酶工程等諸多領域應用廣泛，因其能夠篩選多種單體如細胞、液滴等天然或人工小體，使其具有高通量和高通用性的特性。在未來，熒光激活分選技術將會是最具發展潛力的超高通量篩選技術。