高效液相色譜法測定阿昔莫司中3種有關物質的含量

王向鋒，黃小為，田朋鑫（.郯城縣第一人民醫院，山東 臨沂 7600；.臨沂市檢驗檢測中心，山東 臨沂 76000）

阿昔莫司（acipimox），化學名為5-甲基吡嗪-2-甲酸-4-氧化物，由美國輝瑞制藥公司開發，于1985年首次在意大利上市[1]，1988年被我國列入國家基本藥物品種目錄。阿昔莫司是煙酸衍生物，可降低低密度脂蛋白膽固醇、三酰甘油和載脂蛋白的水平，臨床用于治療高三酰甘油血癥和高膽固醇血癥[2-5]。阿昔莫司多采用5-甲基吡嗪-2-甲酸進行氧化制備[6-8]，在氧化反應的過程中，1位的氮同樣會發生氧化反應，從而生成副產物5-甲基吡嗪-2-甲酸-1-氧化物（雜質Ⅰ）和5-甲基吡嗪-2-甲酸-1，4-二氧化物（雜質Ⅱ）。其反應路線如圖1所示。阿昔莫司的質量標準收載于《中國藥典》2020年版二部[9]，在其質量標準中僅將其起始原料5-甲基吡嗪-2-甲酸（雜質Ⅲ）作為已知雜質，采用外標法進行測定，并未對其副產物雜質進行控制。然而，兩種副產物雜質在精制的過程中并不能完全除去，嚴重影響了阿昔莫司的純度。本文首次建立HPLC方法對阿昔莫司原料藥中3種雜質進行測定，為其質量控制提供依據。

圖1 阿昔莫司的合成路線及雜質的結構式Fig 1 Synthetic route of acipimox and structure formula of impurities

1 儀器與試藥

Agilent1260型高效液相色譜儀，含二極管陣列檢測器、自動進樣器、柱溫箱和二元泵（美國Agilent公司）；Mettler XP205電子分析天平（瑞士Mettler公司）。

阿昔莫司對照品（純度：99.9%，批號：100750-201702）、阿昔莫司雜質Ⅲ對照品（純度：100%，批號：101360-201501）（中國食品藥品檢定研究院）；阿昔莫司雜質Ⅰ對照品（純度：99.7%，批號：D1912011）、阿昔莫司雜質Ⅱ對照品（純度：99.6%，批號：D1912021）（臨沂萊博醫藥公司）；阿昔莫司原料藥（批號：AX200501、AX200502、AX200503，臨沂萊博醫藥公司）；甲醇為色譜純；磷酸與四丁基氫氧化銨均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相：甲醇-0.01 mol·L－1四丁基氫氧化銨溶液（用磷酸調節pH 6.0）（7∶93）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：264 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品儲備液 精密稱取阿昔莫司對照品52.33 mg、雜質Ⅰ對照品51.20 mg、雜質Ⅱ對照品49.56 mg和雜質Ⅲ對照品38.66 mg，分別置50 mL量瓶中，用流動相溶解，并稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 混合對照品溶液 精密量取各對照品儲備液1 mL，置同一1000 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 系統適用性試驗溶液 精密稱取阿昔莫司對照品約10 mg，置10 mL量瓶中，精密加入雜質Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ對照品儲備液各10 μL，用流動相溶解并稀釋至刻度，制成含阿昔莫司約1000 μg·mL－1，含雜質Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ約1 μg·mL－1的溶液，作為系統適用性試驗溶液。

2.2.4 供試品溶液 精密稱取阿昔莫司約100 mg，置100 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.3 專屬性試驗

取“2.2”項下系統適用性試驗溶液、混合對照品溶液、供試品溶液與空白溶液（流動相），分別進樣測定，記錄色譜圖。各成分色譜峰的分離度均大于1.5，以阿昔莫司色譜峰計理論板數在5000以上。

圖2 阿昔莫司HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of acipimox

2.4 線性關系考察

取“2.2”項下對照品儲備溶液10、50、100、500、1000 μL，置100 mL量瓶中，用流動相稀釋制成系列濃度混合對照品溶液，分別進樣，以質量濃度C（μg·mL－1）為橫坐標，峰面積A為縱坐標，進行線性回歸，結果見表1。

表1 3種成分回歸方程、LOD及LOQTab 1 Regression equation，LODs，and LOQs of 3 compounds

2.5 定量限與檢測限

取混合對照品溶液，用流動相逐步稀釋，按“2.1”項下色譜條件測定，分別以S/N＝10、S/N＝3求得雜質Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的定量限（LOQ）和檢測限（LOD），結果見表1。

2.6 精密度、穩定性和重復性

按“2.2.2”項下方法制備混合對照品溶液，連續進樣6次，測定峰面積，結果雜質Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰面積的RSD分別為0.76%、0.82%和0.93%，表明儀器精密度良好。

取同一供試品溶液（批號：AX200501），室溫放置，于0、2、6、12和24 h分別進樣測定，結果雜質Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰面積的RSD分別為0.86%、1.1%和0.84%。表明溶液在室溫條件下放置24 h內穩定。

取同批樣品（批號：AX200501），共6份，分別按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結果雜質Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的含量的RSD分別為0.65%、0.52%和0.77%，表明重復性良好。

2.7 回收試驗

精密稱取已知雜質Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ含量的樣品（批號：AX200501）約50 mg，共9份，置100 mL量瓶中，分別精密加入雜質Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ對照品儲備液10、20和30 μL，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定，計算各有關物質的回收率，結果見表2。

表2 回收試驗Tab 2 Recovery

2.8 耐用性試驗

對方法耐用性進行試驗，分別考察了不同型號的色譜柱CAPCELL CORE C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）和Shim-pack Velox C18（4.6 mm×150 mm，2.7 μm），通過改變色譜柱的柱溫（20℃、40℃及室溫）、流速（0.8 mL·min－1及1.2 mL·min－1）等試驗條件，考察各色譜峰分離情況，結果阿昔莫司峰與相鄰雜質峰以及各雜質峰之間均能達到基線分離。微調流動相中四丁基氫氧化銨溶液的濃度（0.009 mol·L－1和0.011 mol·L－1）和pH值（pH 5.9和pH 6.1）對耐用性進行考察，結果各色譜峰之間分離良好。表明本試驗方法的耐用性良好。

2.9 樣品雜質含量測定

取3批阿昔莫司原料藥，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。采用外標法分別計算雜質Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的含量，結果見表3。

表3 雜質含量測定結果(%，n＝2)Tab 3 Determination of impurity (%，n＝2)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

參考2020年版《中國藥典》二部阿昔莫司有關物質檢查項色譜條件，選用甲醇-0.01 mol·L－1四丁基氫氧化銨溶液作為流動相，并對其比例進行優化。當流動相比例為15∶85（藥典中流動相比例）時，雜質Ⅰ峰與阿昔莫司峰不能完全分離，降低流動相中甲醇的比例，各成分色譜峰的分離度均有較大改善，且均能達到基線分離。

本文采用Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱，該色譜柱為2.7 μm粒徑填料的核殼型色譜柱，由于表面多孔型填料具有極窄的粒徑分布和擴散路徑，同時可以減小渦流擴散，縮短傳質路徑和減弱傳質阻力，其柱效可獲得2 μm粒徑填料的色譜柱同等效果[10-11]。且此類型的色譜柱一般操作壓力在20 MPa左右，故可以在耐壓40 MPa的普通液相色譜系統上運行，使得在普通高效液相色譜儀實現超高效液相色譜的分析效率[12]。

3.2 有關物質分析

阿昔莫司的起始原料5-甲基吡嗪-2-甲酸中吡嗪環的1位和4位氮元素具有相似的活性，在氧化反應過程中，均有被氧化的概率，從而生成雜質Ⅰ和Ⅱ。此兩種氧化物雜質與5-甲基吡嗪-2-甲酸在結構上與阿昔莫司相似，也具有相似的理化性質，在精制過程中不能完全去除。本文檢測結果表明，3種有關物質均有不同程度的殘留，嚴重影響了阿昔莫司的純度，應當建立檢測方法嚴格控制。

3.3 小結

本文建立HPLC方法對3種有關物質的含量進行測定，結果顯示方法靈敏度高，重復性好，結果準確，可用于阿昔莫司原料藥中3種雜質的測定，為阿昔莫司原料藥中有關物質的檢查提供了依據。

致謝：感謝臨沂萊博醫藥公司為本研究無償提供的雜質對照品和阿昔莫司原料藥。