高效液相色譜法測定遼寧不同產(chǎn)地朝鮮淫羊藿油炙前后木蘭花堿的含量

原明月，喬宇航，郭鑫，牛野，王靜，賈天柱，袁子民（遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 大連 116600）

朝鮮淫羊藿為小檗科植物朝鮮淫羊藿Epimedium koreanumNakai的干燥葉，為2020年版《中國藥典》一部淫羊藿多基原藥材的來源之一[1]，主要分布于遼寧省東部、吉林省東部及黑龍江和吉林交界等地，市售的淫羊藿藥材或飲片主要以朝鮮淫羊藿與淫羊藿（心葉）為主，柔毛與箭葉淫羊藿品種較少，朝鮮淫羊藿已成為遼寧省道地藥材及市售淫羊藿藥材的主要來源[2-3]。目前對淫羊藿油炙前后的含量測定主要以黃酮類成分報道較多，有關(guān)炙后對木蘭花堿含量的影響研究尚未見報道，木蘭花堿具有抗焦慮、降壓、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化及抗真菌等藥理活性[4-6]。因此，本研究主要對遼寧不同產(chǎn)地（鳳城、寬甸、桓仁、新賓）朝鮮淫羊藿油炙前后木蘭花堿的含量進行測定與分析，為遼產(chǎn)道地藥材朝鮮淫羊藿生品、炙品質(zhì)量標準制訂、炮制機制的深入研究提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀（美國Agilent）；SG3300型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；電子分析天平（天津天馬衡基儀器有限公司）。

1.2 試藥

木蘭花堿對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號：wkq20031310，含量＞98%），乙腈、磷酸為色譜純，其他均為分析純，水為娃哈哈純凈水。朝鮮淫羊藿藥材于2020年6月采收于遼寧不同產(chǎn)地，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學藥用植物教研室尹海波教授鑒定為小檗科植物朝鮮淫羊藿Epimedium koreanumNakai的干燥葉，按2020年版《中國藥典》一部淫羊藿飲片項下炮制方法制成淫羊藿及炙淫羊藿。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A相為乙腈，B相為0.1%磷酸，梯度洗脫（0～8 min，10%A；8～20 min，10%～15%A；20～40 min；15%～35%A；40～45 min，35%～80%A）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：226 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。在該色譜條件下，空白溶劑無干擾，淫羊藿、炙淫羊藿供試品中木蘭花堿峰的理論板數(shù)分別為31 911、33 058，分離度均為1.83。色譜圖見圖1。

圖1 對照品（A）、淫羊藿（B）、油炙淫羊藿（C）、空白溶劑（D）的HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of reference substance（A），epimedii folium（B），epimedii folium prepared with oil frying（C），and blank solution（D）

2.2 對照品溶液

取木蘭花堿對照品適量，精密稱定，分別置于100 mL量瓶中，加50% 乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含木蘭花堿38.8 μg·mL－1的對照品溶液。

2.3 供試品溶液

分別稱取淫羊藿、炙淫羊藿粉末（過三號篩）0.2 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 50%乙醇，稱定重量，超聲（功率250 W，頻率30 kHz）處理30 min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取木蘭花堿對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、10.0 mL分別置10 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，搖勻，即得不同質(zhì)量濃度的系列對照品溶液。按照“2.1”項下色譜條件測定，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為Y＝43.01X＋6.821（r＝0.9998），表明木蘭花堿在3.88～38.8 μg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

取同一炙淫羊藿供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算木蘭花堿的RSD為0.44%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一炙淫羊藿粉末（過三號篩），按“2.3”項下方法分別制備6份供試品溶液，測定木蘭花堿的含量，其平均含量為3.28 mg·g－1，RSD為2.4%，表明該法重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一炙淫羊藿供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，分別在0、2、4、6、8、10 h進樣測定，記錄峰面積，計算木蘭花堿的RSD為2.1%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗

分別取同一炙淫羊藿粉末（已知木蘭花堿含量為0.328%）0.1 g各6份，精密稱定，分別精密加入木蘭花堿對照品溶液（38.8 μg·mL－1）8.0 mL，再精密加入50%乙醇17.0 mL，其余按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液。按照“2.1”項下色譜條件操作，結(jié)果平均回收率為97.6%，RSD為1.2%，符合測定要求。

2.9 樣品含量測定

分別取不同產(chǎn)地的淫羊藿、炙淫羊藿粉末，按“2.3”項下方法分別制備供試品溶液，在同一色譜條件下測定木蘭花堿的含量，結(jié)果見表1。

表1 木蘭花堿含量測定結(jié)果(n＝3)Tab 1 Content of magnoflorine (n＝3)

3 討論

3.1 檢測波長的篩選

將木蘭花堿對照品溶液在200～400 nm進行掃描，發(fā)現(xiàn)木蘭花堿在226、271、318 nm處均有吸收，但在226 nm處吸收最強，綜合考慮分離度及溶劑影響，本文選擇226 nm作為紫外檢測波長。

3.2 流動相的篩選

對于淫羊藿中木蘭花堿的含量測定的文獻報道中多采用乙腈-0.5 mol·L－1KH2PO4溶液[7-9]或乙腈-0.1 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液[10-11]（14∶86）為流動相進行等度洗脫，但由于木蘭花堿極性較大，供試品樣品中還含有大量中等極性、極性小的成分，大量樣本測定時采用等度洗脫易造成色譜柱污染。本研究對流動相篩選，最后采用配制方法簡單的乙腈-0.1%磷酸為流動相[12]，梯度洗脫，能夠使各色譜峰達到較好的分離，利于保護色譜柱，適合大批量樣本測定。

3.3 小結(jié)

本文分別對淫羊藿、炙淫羊藿進行了木蘭花堿含量測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)遼寧的4個產(chǎn)地中，丹東鳳城東湯鎮(zhèn)含量最高，本溪桓仁八里甸子鎮(zhèn)含量最低；經(jīng)羊脂油炮制后的炙淫羊藿中結(jié)果木蘭花堿含量均比生品降低，這與文獻報道中黃柏炮制后木蘭花堿含量降低一致[13]，表明木蘭花堿遇熱可能不穩(wěn)定，其降低原因尚需進一步研究。