超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法定性分析鹽酸阿呋唑嗪中的雜質

王軍，邱榮英，李鐵健，張貴民*（1.山東新時代藥業有限公司，山東 臨沂 273400；2.國家手性制藥工程技術研究中心，山東 臨沂 273400；3.魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂 276005）

鹽酸阿呋唑嗪，化學名為N-{3-[（4-氨基-6，7-二甲氧基-2-喹唑啉基）甲基氨基]丙基}-2-四氫呋喃甲酰胺鹽酸鹽，是一種喹唑啉衍生物，屬α1腎上腺素能受體拮抗劑，其化學結構見圖1。該藥物能高選擇性地與前列腺的α1-受體競爭性結合，影響α1受體介導的平滑肌收縮，減輕良性前列腺增生患者的排尿障礙[1]，有效改善尿頻、尿急、排尿困難等臨床癥狀[2]，對輸尿管結石也有一定療效[3]。該藥物由賽諾菲-圣德拉堡公司研發，于1988年在法國首次上市，其緩釋片劑于2003年在美國上市，2004年底在中國上市[4]。

圖1 鹽酸阿呋唑嗪結構式Fig 1 Structure of alfuzosin hydrochloride

目前國內外對鹽酸阿呋唑嗪的研究主要集中在合成[1，4-7]、制劑[8-11]與藥物動力學方面[12-16]，分析方法主要包括液相色譜法[10，14-15，17-19]與高效薄層色譜法[20]，利用高效液相色譜-質譜（LCMS/MS）法對其雜質研究未見報道。隨著公眾與媒體對藥物安全性的日益關注，對藥物中的雜質控制已成為藥品質量控制的重要環節，開展雜質研究不僅能定性雜質，還能提示工藝改進。本文采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）法首次對鹽酸阿呋唑嗪中的雜質進行了定性分析，為下一步工藝優化與質量研究提供依據。

1 儀器與試藥

1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色譜、G6540B四極桿-飛行時間質譜儀（美國Agilent公司），配有電噴霧離子源（ESI）以及MassHunter B.06.00數據處理系統。鹽酸阿呋唑嗪（企業A）；乙腈（色譜純，美國Merck公司）；乙酸銨（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司）；實驗用水為自制超純水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱Thermo Hypersil gold aq C18柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流動相：A相為10 mmol·L－1乙酸銨水溶液，B相為乙腈；梯度洗脫（洗脫程序為：0～3 min，10%B；3～10 min，10%～95%B；10～11 min，95%～10%B；11～15 min，10%B）。柱溫為40℃；波長為245 nm；流速為0.3 mL·min－1；進樣量為 2 μL。

2.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式；掃描范圍m/z50～800；霧化氣溫度：300℃；毛細管電壓4 kV，干燥氣流速10 L·min－1；裂解電壓60 V；錐孔電壓45 V；碰撞能量：30 eV。

2.3 供試品溶液的配制

稱取鹽酸阿呋唑嗪樣品10.0 mg，置于10 mL量瓶中，用流動相稀釋定容，取適量過0.2 μm濾膜，即得。

3 結果與討論

3.1 UPLC-Q-TOF-MS方法的優化

目前歐洲藥典9.6版檢測鹽酸阿呋唑嗪的方法為高氯酸溶液與乙腈用梯度洗脫進行分析[21]，由于高氯酸為無機酸，無法直接進入質譜進行樣品分析，因此需要轉換為揮發性流動相進行分析。經過優化最終采用乙酸銨水溶液與乙腈進行梯度洗脫，優化梯度洗脫條件后，各雜質均具有較好的質譜響應值，有利于下一步雜質的定性分析。

鹽酸阿呋唑嗪的分子量小于800 Da，由于雜質結構與其相似，最終選定了質譜采集范圍為m/z50～800。在質譜中獲得雜質的一級譜圖后，分別對各母離子優化碰撞能量，最終確定為30 eV。在最終確定的測定條件下獲得各雜質的二級質譜碎片離子，并據此對各雜質的可能結構進行推導。

3.2 供試品溶液UPLC圖譜

供試品溶液的UPLC圖見圖2，按照出峰時間依次對雜質編號1～6。鹽酸阿呋唑嗪在溶液中解離，因此在UPLC圖中主峰為阿呋唑嗪。雜質4與雜質5雖然未能達到基線分離，但是不影響定性分析。

圖2 阿呋唑嗪供試品溶液的UPLC圖譜Fig 2 UPLC chromatogram of alfuzosin

3.3 阿呋唑嗪質譜信息

樣品主成分阿呋唑嗪的二級質譜圖見圖3。母離子峰m/z390.2149 [M＋H]＋，其碎裂途徑如圖4所示：由圖中A示線斷裂后，按照途徑a進行碎裂，首先生成碎片m/z275.1505，元素組成為C14H19N4O2＋，該碎片脫去亞乙基生成m/z247.119，繼續失CH2后生成m/z235.1192，繼續失CH2后繼續丟失兩個H生成m/z219.0877；由圖中B示線斷裂后，失去B線右側C11H13N4O2基團，按照途徑b生成碎片m/z156.1019，進一步丟失C4H7NO，生成m/z71.0495。

圖3 阿呋唑嗪的二級質譜圖Fig 3 MS2 spectrum of alfuzosin

圖4 阿呋唑嗪的裂解途徑Fig 4 Fragmentation pathway of alfuzosin

3.4 雜質結構解析

3.4.1 雜質質譜信息 6個雜質經過UPLC-QTOF-MS分析后，獲得精確分子量與二級質譜碎片。通過精確分子量利用MassHunter軟件計算出分子式，各精確分子量與理論值的誤差均小于5×10－6，結合二級質譜碎片推導各雜質結構，具體信息見表1。

表1 鹽酸阿呋唑嗪中雜質的質譜信息Tab 1 MS information of impurities in alfuzosin hydrochloride

3.4.2 雜質結構解析 在原料藥的生產過程中，雜質與原料藥在結構上較相近，因此可以通過對比原料藥的質譜碎裂特征鑒定雜質的化學結構[23]。本文結合阿呋唑嗪的裂解規律與雜質的碎片離子對各雜質結構解析如下。

雜質1：二級質譜圖見圖5，母離子m/z292.1771 [M＋H]＋，經過軟件計算分子式C14H21N5O2。由于存在碎 片m/z275.1508，m/z247.1196，m/z219.0879，其形成機制參考阿呋唑嗪的a裂解途徑，說明含有阿呋唑嗪部分結構（即C14H19N4O2）；碎片m/z191.0826由m/z247.1196失去一個甲氧基與兩個甲基生成；碎片m/z259.1194為m/z275.1508失去CH2后，繼續丟失兩個H形成的。由此判斷雜質1結構與可能的二級斷裂機制如圖6所示。

圖5 雜質1的MS2質譜圖Fig 5 MS2 spectrum of impurity 1

圖6 雜質1可能的裂解途徑圖Fig 6 Proposed fragmentation pathway of impurity 1

雜質2：二級質譜圖見圖7，母離子m/z488.2521 [M＋H]＋，經過軟件計算分子式為C24H33N5O6，比阿呋唑嗪多了C5H6O2，初步判斷該基團為2-甲酰基四氫呋喃，雜質母離子丟失該基團后生成碎片m/z390.2149，同阿呋唑嗪母離子結構，碎片m/z275.1504，m/z235.1193，m/z156.1021，m/z71.0496形成機制參考阿呋唑嗪碎裂機制；碎片m/z333.1567為母離子丟失兩個四氫呋喃環后，再失去氨基生成。由此可判斷雜質2結構與可能的裂解機制如圖8所示。

圖7 雜質2的MS2質譜圖Fig 7 MS2 spectrum of impurity 2

圖8 雜質2可能的裂解途徑圖Fig 8 Proposed fragmentation pathway of impurity 2

雜質3：二級質譜圖見圖9，母離子m/z235.1192 [M＋H]＋，經過軟件計算分子式C11H14N4O2，由于該母離子峰與阿呋唑嗪二級碎片m/z235.1192相同，初步推斷二者為同一結構；其中碎片m/z219.0883形成機制參考阿呋唑嗪a途徑碎裂機制；碎片m/z191.0927由母離子m/z235.1192失去一個甲氧基與一個甲基生成。由此判斷雜質3的結構與可能的斷裂機制如圖10所示。

圖9 雜質3的MS2質譜圖Fig 9 MS2 spectrum of impurity 3

圖10 雜質3可能的裂解途徑圖Fig 10 Proposed fragmentation pathway of impurity 3

雜質4：二級質譜圖見圖11，母離子m/z320.1726 [M＋H]＋，經過軟件計算分子式為C15H21N5O3，由于存在碎片離子m/z275.1504，m/z247.1194，m/z235.1193，m/z219.088，其形成機制參考阿呋唑嗪的a裂解途徑，說明含有阿呋唑嗪部分結構（即C14H19N4O2）；碎片m/z191.0905由m/z235.1193失去一個甲氧基與一個甲基生成。碎片m/z86.0604經過軟件計算元素組成為C4H8NO＋，該碎片失去亞乙基后生成碎片m/z58.0292。由上可以推斷雜質4的結構與可能的裂解機制如圖12所示。

圖11 雜質4的MS2質譜圖Fig 11 MS2 spectrum of impurity 4

圖12 雜質4可能的裂解途徑圖Fig 12 Proposed fragmentation pathway of impurity 4

雜質5二級質譜圖見圖13，二級母離子m/z288.1454 [M＋H]＋，經過軟件計算分子式C14H17N5O2，由于存在碎片m/z247.1188，m/z219.0885，其形成機制參考阿呋唑嗪的a裂解途徑，說明含有阿呋唑嗪部分結構（即C14H19N4O2）；碎片m/z191.0823形成機制參考雜質1裂解過程；碎片m/z272.1139為母離子丟失一個甲基形成的。由此判斷雜質5結構與可能的二級斷裂機制如圖14所示。

圖13 雜質5的MS2質譜圖Fig 13 MS2 spectrum of impurity 5

圖14 雜質5可能的裂解途徑圖Fig 14 Proposed fragmentation pathway of impurity 5

雜質6二級質譜圖見圖15，母離子m/z364.1979 [M＋H]＋，經過軟件計算分子式為C17H25N5O4，碎片m/z318.1564為母離子失去C2H5O生成。碎片離子m/z275.1501、m/z247.1187、m/z235.1188、m/z219.0876形成機制參考鹽酸阿呋唑嗪a裂解途徑，說明含有阿呋唑嗪部分結構（即C14H19N4O2）；雜質母離子失去C11H13N4O2基團形成碎片m/z130.0859，結合鹽酸阿呋唑嗪b裂解機制可以判斷出C11H13N4O2基團結構；碎片m/z130.0859失去乙基生成碎片m/z102.055，繼續失去CH2生成碎片m/z74.0239。由此可判斷雜質6結構與可能的裂解機制如圖16所示。

圖15 雜質6的MS2質譜圖Fig 15 MS2 spectrum of impurity 6

圖16 雜質6可能的裂解途徑圖Fig 16 Proposed fragmentation pathway of impurity 6

3.4.3 雜質來源推測 根據表1中解析的雜質結構，結合文獻報道工藝路線[4]，對各雜質來源分析如下：雜質1為合成路線里的中間體，推斷為該物料未反應完全，帶入了鹽酸阿呋唑嗪中。目前歐洲藥典9.6版收載了阿呋唑嗪7個雜質，分別為雜質A～G[21]，雜質1與歐洲藥典中的雜質D結構一致，化學名為N-甲基-N-（4-氨基-6，7-二甲氧基-2-喹唑啉基）-1，3-丙二胺；雜質2結構中含有兩個甲酰基四氫呋喃基團，推測為一分子的雜質1與兩分子的2-四氫呋喃甲酸反應生成；雜質3為甲胺與2-氯-4-氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉反應形成；雜質4推測為雜質1與甲酸反應生成，該雜質與歐洲藥典中的雜質E結構一致，化學名為N-{3-[（4-氨基-6，7-二甲氧基）甲氨基]丙基}甲酰胺。雜質5為合成路線里的中間體，化學名為3-[N-（4-氨基-6，7-二甲氧基-2-喹唑啉基）-N-甲基氨基]丙腈，該物料未反應完全，帶入了鹽酸阿呋唑嗪中；雜質6為雜質1與氯甲酸乙酯反應生成。

4 小結

LC-Q-TOF-MS有利于研究化合物質譜裂解規律，通過比較藥物主成分與有關物質的多級質譜數據的異同，可快速推斷有關物質發生的變化，為最終確定雜質結構提供可靠信息[22]。本文采用UPLC-Q-TOF-MS法對鹽酸阿呋唑嗪中的6個雜質進行了定性研究。通過鹽酸阿呋唑嗪的二級質譜特征碎片離子，推導了6個雜質的結構，結合其結構推測雜質為合成過程中產生，需優化工藝路線，增加過程監控，減少甚至避免雜質的產生。本文可為鹽酸阿呋唑嗪的工藝優化與質量控制提供參考。