超高效液相色譜-串聯三重四級桿質譜法測定中成藥及保健食品中非法添加的15種抗組胺類化學成分

張崇生，倪贊，葉建晨，吳大升，劉萌（溫州市食品藥品檢驗科學研究院，浙江 溫州 325008）

世界變態反應組織（World Allergy Organization，WAO）統計表明，過去30年間，變態反應性疾病如過敏性哮喘、變應性鼻炎、慢性蕁麻疹和皮膚瘙癢癥等發病率增長了3倍，患病率達22%[1]，主要由多種炎癥細胞在變應原的刺激下誘發，具有易發、復發和多慢性的特點。其中肥大細胞及其釋放的組胺在變態反應性疾病發生發展過程中發揮重要作用[2]，因此在變態反應性疾病的治療中，組胺及其受體是重要的治療靶點，抗組胺藥物也被WAO納入一線診療推薦方案。中成藥及保健食品不良反應小，可長期服用，尤其契合變態反應性疾病慢性治療和調理的特點，因此備受人們青睞。不法分子迎合需要，在標稱止咳平喘、抗過敏、鎮靜安神、主治變應性鼻炎和皮膚病等中成藥及保健食品非法添加抗組胺類化學成分，達到用量小和見效快的目的，牟取暴利[3]。人們在不知情的情況下長期過量服用添加此類藥物的中成藥及保健食品，會引發嗜睡、口干、呼吸抑制、眼壓升高、過敏性休克、心臟毒性和致畸等不良反應[4-7]。

目前中成藥及保健食品中非法添加化學藥的行為已受到人們廣泛關注，但是對非法添加抗組胺類化學成分的研究報道較少，主要采用液相色譜法[8]，但其分離費時費力，靈敏度低。國內外報道發現抗組胺藥物已達40余種，按功能及作用機制可分為第一、二和三代[9]，現有文獻同時分析種類最多為7種，且多集中于第一代抗組胺藥物[10]。本實驗選擇臨床常用的分屬一、二、三代的15種抗組胺類化學成分為目標物，采用超高效液相色譜-串聯三重四級桿質譜（UPLC-MS/MS），以多離子反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）為檢測模式，快速檢測中成藥以及保健食品中非法添加的抗組胺類化學成分，該法靈敏度高、準確度好和選擇性強，可以消除中成藥以及保健食品等復雜基質干擾，大大提高檢測效率，為新形勢下的藥品和保健品監管提供了強有力的技術保障。

1 材料

Agilent 1290 InfinityⅡ超高效液相色譜儀，Agilent 6495 Triple Quad質譜儀，配Masshunter工作站（美國安捷倫公司）；XS205DU十萬分之一分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SB-5200D 超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Milli-Q Integral 5超純水器（德國密理博公司）。

對照品地氯雷他定（批號：100919-201904）、馬來酸氯苯那敏（批號：100047-201507）、阿司咪唑（批號：100301-199901）、鹽酸苯海拉明（批號：100066-200807）、鹽酸異丙嗪（批號：100422-201603）、鹽酸羥嗪（批號：100266-200201）、奮乃靜（批號：100133-200602）、鹽酸西替利嗪（批號：100660-201803）、鹽酸氟奮乃靜（批號：100162-201604）、鹽酸氯丙嗪（批號：100460-201302）、氯雷他定（批號：100615-201404）、特非那定（批號：100292-201302）、鹽酸賽庚啶（批號：100502-201802）（中國食品藥品檢定研究院），鹽酸曲吡那敏（批號：G981254）和馬來酸溴苯那敏（批號：G155522）（Laboratory of the Government Chemist公司）。53批樣品主要來源為2014－2020年國家保健食品安全風險監測抽樣和市縣食藥監局聯合公安部門打四非專項行動抽樣，部分通過互聯網以及微商購買。試劑甲醇（美國Merck公司）、甲酸和甲酸銨（阿拉丁公司）為色譜純，水由密理博公司超純水器制得。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：A為0.1%甲酸-10 mmol·L－1甲酸銨，B為甲醇，梯度程序：0～1.5 min，50%A；1.5～3.0 min，50%～35%A；3.0～10.0 min，35%～0%A；10.0～11.0 min，0%A；11.0～11.1 min，0%～50%A；11.1～13.0 min，50%A；柱溫：35℃；進樣量：2 μL；流速：0.3 mL·min－1。

2.2 質譜條件

離子源：AJS電噴霧離子源，正離子模式（ESI＋）；掃描方式：多反應監測（MRM）；霧化器壓力：30 psi；干燥氣流速：17 L·min－1，干燥器溫度：200℃；鞘氣流速：11 L·min－1，鞘氣溫度：350℃；毛細管電壓：4000 V；噴嘴電壓：0 V；碎裂電壓：380 V。優化后的質譜參數見表1，典型的總離子流圖見圖1。

表1 15種抗組胺類化學成分的保留時間和質譜參數Tab 1 Retention time and mass spectrometry parameters of 15 antihistamine agents

圖1 15種抗組胺類化學成分總離子流圖（峰號見表1）Fig 1 Total ion chromatogram of 15 antihistamine agents（peak numbers in tab 1）

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品儲備液的制備 稱取各對照品50 mg，用甲醇配制成質量濃度為1 mg·mL－1的單一對照品溶液。精密量取單一對照品液各0.5 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，精密量取1 mL，用甲醇稀釋10倍，作為混合對照品儲備液（S儲，2.5 μg·mL－1）。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取供試樣品0.2 g（顆粒劑或片劑需研細，硬膠囊去殼研細，口服液直接稱取），置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇適量超聲提取（功率200 W，頻率25 kHz）20 min，冷卻至室溫，加甲醇定容至刻度，5000 r·min－1離心5 min，取上清液，經微孔濾膜（0.22μm，有機相）過濾，取續濾液待測。如果檢測后判定為非法添加的陽性樣品，其濃度超出線性范圍，則在此基礎上繼續稀釋。

2.4 標準曲線和線性范圍

精密量取“2.3.1”項下混合對照品儲備液適量，用甲醇稀釋成2、5、10、20和50 ng·mL－1系列質量濃度的混合對照品溶液S1～S5（按質量濃度由低到高順序編號），按“2.1”和“2.2”項下條件測定，以各化合物定量離子對峰面積值Y對質量濃度X（ng·mL－1）進行線性回歸，各化合物的線性范圍、回歸方程和相關系數見表2。結果表明15種抗組胺化學藥在各自質量濃度范圍內與峰面積均呈良好線性關系，r均大于0.998。

2.5 檢測限和定量限試驗

精密量取“2.3.1”項下混合對照品儲備液適量，用甲醇定量稀釋，按“2.1”和“2.2”項下條件進行測定，以3倍信噪比計算檢測限，以10倍信噪比計算定量限，結果見表2。

2.6 精密度試驗

取“2.4”項下S3混合對照品溶液2 μL，按“2.1”和“2.2”項下條件測定，連續測定6次，計算，結果上述15種抗組胺類化學成分的峰面積RSD在0.90%～3.8%（見表2），表明方法的進樣精密度良好。

表2 15種抗組胺類化學成分的線性參數、檢測限、定量限和精密度Tab 2 Linearity parameters，quantitation limits，detection limits and precisions for 15 antihistamine agents

2.7 重復性試驗

選擇陽性檢出率較高的膠囊制劑陰性樣品作為回收試驗基質，精密稱取膠囊內容物0.2 g，共6份，分別置于50 mL量瓶中，精密加入“2.3.1”項下混合對照品儲備液0.5 mL，照“2.3.2”項下方法制備，按“2.1”和“2.2”項下條件測定，15種抗組胺類化學成分峰面積RSD在0.40%～3.9%，表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收試驗

精密稱取“2.7”項下膠囊內容物0.2 g，置于50 mL量瓶中，精密加入“2.3.1”項下混合對照品儲備液1 mL和S5混合對照品液 2 mL，作為高、低濃度回收率組。每個濃度水平配制6份，按“2.1”和“2.2”項下條件進行測定，結果15種抗組胺類化學成分的平均回收率均在82.9%～114.9%，峰面積RSD在0.080%～5.1%。

2.8 穩定性試驗

取“2.4”項下S3混合對照品溶液，在室溫放置0、4、8、12、16、20和24 h后，按“2.1”和“2.2”項下條件測定，結果15種抗組胺類化學成分的峰面積RSD在1.4%～3.3%（n＝6），表明15種抗組胺類化學成分溶液在24 h內穩定。

2.9 樣品測定

53批標稱止咳平喘、抗過敏、鎮靜安神、主治變應性鼻炎和皮膚病等類中成藥及保健食品照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”和“2.2”項下條件測定，通過比較樣品與對照品的保留時間以及定性離子對的相對豐度，判定樣品中是否含有非法添加的藥物。結果有8批樣品呈非法添加陽性，陽性率為15.1%，陽性樣品結果見表3。非法添加抗組胺類化學成分按頻次依次為氯苯那敏、氯雷他定和異丙嗪，其中氯苯那敏和氯雷他定在內服制劑與外用軟膏和洗劑中均有發現，異丙嗪在內服制劑中發現。8批陽性樣品中有4批是標稱止癢抗過敏，在不知情的情況下長期使用此類中成藥及保健食品，容易導致藥物依賴性皮炎，重則直接或間接導致死亡，值得監管部門的警惕與重視。

表3 陽性樣品非法添加成分種類及含量Tab 3 Types and contents of detected components in positive samples

3 討論

15種抗組胺類化學成分采用ESI＋正離子檢測模式，為保證離子化效率，本方法分別比較了甲酸、甲酸-甲酸銨和乙酸-乙酸銨體系，發現甲酸-甲酸銨體系離子化效率最高，甲酸有助于化合物離子化，獲得較優的色譜分離和質譜響應，甲酸銨能有效改善氯雷他定、氯苯那敏和氯丙嗪的峰形。兩者形成的緩沖體系，通過離子強度和洗脫優化，最終確定0.1%甲酸-10 mmol·L－1甲酸銨為流動相體系，15種抗組胺類化學成分經梯度洗脫可在9.0 min內得到分離。本方法利用Agilent Masshunter Optimizer軟件，優化母離子、碎裂電壓、子離子和碰撞能量等質譜參數，特異性選擇兩級離子，確定合適的定性和定量離子，比對定性離子相對豐度比，排除干擾，確證陽性結果，同時保證定量離子響應，兼顧定性和定量要求。

本方法前處理簡單，采用UPLC-MS/MS法在非常短的時間內實現了對15種抗組胺類化學成分快速分析，各化合物在MRM色譜圖均得到有效分離，母離子和子離子碎片等質譜信息精度高，陽性結果定性準確，定量靈敏度高，可為監管部門打擊非法添加行為和保障群眾的食藥安全提供技術保障。