吸入藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)策略

劉學(xué)武，陳瓊芳，唐小燕，姜德建，張妙紅（湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司 ＆ 湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心 ＆ 新藥藥效與安全性評(píng)價(jià)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410331）

吸入給藥是通過(guò)直接作用于呼吸系統(tǒng)來(lái)發(fā)揮局部和全身治療作用的一種特殊給藥途徑。對(duì)于局部性的適應(yīng)證（如咽峽炎、氣管-支氣管炎、肺炎等），吸入給藥能通過(guò)藥物在呼吸系統(tǒng)局部的高暴露（直接作用于患病部位）和持續(xù)滯留而發(fā)揮其治療作用和優(yōu)勢(shì)；對(duì)于全身性的適應(yīng)證，吸入給藥能繞過(guò)肝臟首過(guò)效應(yīng)而增加其生物利用度。但吸入給藥最大的安全性風(fēng)險(xiǎn)也來(lái)自于呼吸系統(tǒng)局部的藥物高暴露和持續(xù)滯留，同時(shí)呼吸系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜、吸入制劑給藥較為復(fù)雜（屬于藥械組合）等特點(diǎn)則為吸入給藥的安全性評(píng)價(jià)帶來(lái)了一定挑戰(zhàn)。

1 吸入給藥安全性評(píng)價(jià)一般考慮

吸入制劑的安全性評(píng)價(jià)應(yīng)根據(jù)其研發(fā)目的進(jìn)行研究?jī)?nèi)容的選擇，對(duì)于1類創(chuàng)新藥，通常應(yīng)進(jìn)行兩個(gè)種屬的一般毒性試驗(yàn)（嚙齒類一般為大鼠，非嚙齒類一般為Beagle犬，生物制劑可選擇非人靈長(zhǎng)類）、安全性藥理試驗(yàn)（中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管呼吸系統(tǒng)）、特殊安全性試驗(yàn)（呼吸道刺激性試驗(yàn)和主動(dòng)全身過(guò)敏試驗(yàn)，其中刺激性試驗(yàn)可伴隨在重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中進(jìn)行考察）、特殊毒性試驗(yàn)（遺傳毒性、生殖毒性和致癌性）。對(duì)于改良型新藥，應(yīng)根據(jù)其原有劑型和途徑的特點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)試驗(yàn)項(xiàng)目的選擇，美國(guó)食品藥品管理局（U.S.Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）對(duì)改劑型和改變給藥途徑藥品的非臨床安全性評(píng)價(jià)的原則主要通過(guò)暴露量的差異（新劑型/新給藥途徑vs舊劑型/舊給藥途徑）進(jìn)行評(píng)估[1]，當(dāng)現(xiàn)有毒性資料不足以支持新劑型/新給藥途徑的暴露量，或新劑型/新途徑的體內(nèi)暴露模式較原劑型或原途徑有明顯改變時(shí)，應(yīng)針對(duì)新劑型/新給藥途徑開展對(duì)應(yīng)的毒性試驗(yàn)研究。因此，針對(duì)改良型吸入制劑，不管適應(yīng)證是局部或全身，可通過(guò)現(xiàn)有暴露途徑的安全性數(shù)據(jù)的橋接，來(lái)評(píng)估新劑型/新給藥途徑的安全性風(fēng)險(xiǎn)（包括對(duì)暴露靶器官或暴露模式的評(píng)估等），并可通過(guò)新開展部分安全性試驗(yàn)（如一般毒性等）補(bǔ)充所缺乏的安全性信息，如甘露醇靜脈改吸入的改劑型研究[2]增補(bǔ)了一般毒性伴隨毒代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)研究，其他安全性評(píng)價(jià)研究（生殖毒性、遺傳毒性、致癌性等）均引用了甘露醇靜脈給藥途徑的相關(guān)毒理學(xué)數(shù)據(jù)（高暴露途徑評(píng)估低暴露途徑）。另外，肺臟含有以巨噬細(xì)胞為主的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，氣溶膠吸入后可通過(guò)激活抗原，引發(fā)胃腸外的免疫反應(yīng)[3]，其中以蛋白/多肽類吸入制劑較易誘發(fā)肺臟的過(guò)敏反應(yīng)，故針對(duì)吸入給藥途徑的生物制品，應(yīng)通過(guò)吸入給藥的全身過(guò)敏試驗(yàn)，考察受試物導(dǎo)致的呼吸系統(tǒng)主動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。

2 吸入給藥安全性評(píng)價(jià)的影響因素

2.1 受試物

受試物信息的全面性是安全性評(píng)價(jià)的前提，基本信息應(yīng)包括處方組成、來(lái)源、批號(hào)、儲(chǔ)存條件、有效期、溶解性和配制方法等[4]。對(duì)于不同類型的吸入制劑，其受試物信息側(cè)重點(diǎn)應(yīng)有不同，例如干粉吸入劑（dry power inhalation，DPI）通常采用微粉給藥，其受試物信息的側(cè)重點(diǎn)應(yīng)包括以下幾個(gè)方面：

① 處方組成：制劑處方通常由有效成分和輔料成分組成，DPI的輔料包括乳糖、硬脂酸鎂、甘油、甘氨酸等。輔料的使用對(duì)吸入制劑的穩(wěn)定性、顆粒形成、流動(dòng)性及藥物的沉積和吸收均有不同的促進(jìn)作用，但同時(shí)也會(huì)帶來(lái)安全性風(fēng)險(xiǎn)。FDA對(duì)吸入制劑中輔料的種類和用量均有明確規(guī)定[5]，如DPI中無(wú)水的乳糖限度不應(yīng)超過(guò)2.5%。對(duì)于處方中含有特殊輔料的，應(yīng)進(jìn)行輔料的安全性評(píng)估，例如格隆溴銨吸入粉霧劑的輔料主要為乳糖一水合物、硬脂酸鎂等，故其重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)設(shè)置輔料對(duì)照組（1%硬脂酸鎂和99%乳糖一水合物）考察輔料的安全性[6]。

② 粒徑分布：吸入制劑進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)時(shí)，需對(duì)氣溶膠的質(zhì)量中值粒徑（median mass aerodynamic diameter，MMAD）和幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差（geometric standard deviation，GSD）進(jìn)行監(jiān)測(cè)，其中經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organisation for Economic Co-operation and Development，OECD）吸入毒性試驗(yàn)指導(dǎo)原則對(duì)氣溶膠的MMAD要求為1～4 μm（建議為1～2 μm），其目的是充分暴露受試物對(duì)呼吸道下段（支氣管和肺臟）的安全性風(fēng)險(xiǎn)。吸入氣霧劑和吸入溶液所形成氣溶膠的粒徑分布主要與其配套的器械直接相關(guān)。DPI的粒徑分布則屬于其本身的物理屬性，但其粒徑分布的穩(wěn)定性與儲(chǔ)存條件和給藥時(shí)的濕度直接相關(guān)[7]，濕度過(guò)高可能引起微粉聚集和成團(tuán)等問(wèn)題，從而改變吸入微粉本身的粒徑分布和顆粒屬性，熊蓮潔等[8]對(duì)鮭降鈣素吸入粉霧劑的粒徑分布研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)濕度為23%和52%時(shí)，微粉成圓整的分散狀態(tài)；但當(dāng)相對(duì)濕度達(dá)75%時(shí)，發(fā)生較多的粘連和聚集，粒徑分布有較大改變。因此DPI進(jìn)行霧化給藥時(shí)，常會(huì)因其吸入微粉的高吸濕性導(dǎo)致其實(shí)際粒徑分布有較大偏離[9]。故在進(jìn)行DPI非臨床研究時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格控制濕度，以真實(shí)地反應(yīng)受試物的安全性問(wèn)題。

2.2 給藥方式

2.2.1 給藥途徑 吸入制劑的給藥途徑包括經(jīng)口鼻吸入給藥（吸入溶液）和經(jīng)口腔吸入給藥（氣霧劑和粉霧劑），非臨床研究的給藥途徑原則上需與臨床擬用途徑一致，但同時(shí)需兼顧動(dòng)物的依從性和可操作性等因素。吸入制劑在非臨床研究階段，以經(jīng)口鼻吸入給藥與臨床擬用途徑最為接近，通常采用吸入染毒艙進(jìn)行口鼻吸入給藥，以最大限度地模擬吸入制劑的給藥方式。

2.2.2 給藥頻次及時(shí)長(zhǎng) 吸入制劑的給藥時(shí)長(zhǎng)不宜過(guò)長(zhǎng)，OECD指導(dǎo)原則對(duì)急性毒性試驗(yàn)的推薦最長(zhǎng)給藥時(shí)長(zhǎng)為6 h[10]。重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的時(shí)長(zhǎng)以滿足暴露量為目的，在暴露量足夠的情況下，15～30 min較為合適。當(dāng)氣溶膠濃度較小時(shí)，只能通過(guò)延長(zhǎng)給藥時(shí)長(zhǎng)來(lái)增加暴露量，但最長(zhǎng)不宜超過(guò)1 h，給藥頻次一般為1次·d－1。吸入給藥時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間和反復(fù)多次的保定會(huì)影響動(dòng)物的狀態(tài)[11-12]，導(dǎo)致各項(xiàng)生理參數(shù)偏離實(shí)驗(yàn)室的背景數(shù)據(jù)，影響藥物的毒性評(píng)價(jià)。如格隆溴銨吸入粉霧劑的藥理毒理申報(bào)資料顯示，每日采用面罩經(jīng)口鼻吸入60 min未引起B(yǎng)eagle犬的體重增長(zhǎng)和其他生理參數(shù)的異常，但每日連續(xù)120 min經(jīng)口鼻吸入給藥后發(fā)現(xiàn)，與空氣對(duì)照組比較，輔料對(duì)照組大鼠體重增長(zhǎng)速度顯著降低[6]。福莫特羅粉霧劑的Beagle犬一般毒性試驗(yàn)則采用不同暴露時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行劑量區(qū)分，其中低、中、高劑量的暴露時(shí)長(zhǎng)分別為15 min/次、30 min/次、60 min/次[13]。

2.3 給藥劑量

2.3.1 劑量間距的設(shè)置 吸入制劑的非臨床評(píng)價(jià)通常需設(shè)置至少3個(gè)給藥劑量，以反映受試物的量效關(guān)系。吸入制劑給藥劑量與諸多因素相關(guān)，包括氣溶膠濃度、吸入時(shí)間和吸入對(duì)象的呼吸狀態(tài)（如呼吸頻率、潮氣量等），故劑量間距可適當(dāng)擴(kuò)大，以避免出現(xiàn)暴露量與給藥劑量倒置的現(xiàn)象，通常至少應(yīng)達(dá)到3倍的劑量間距，如阿福莫特羅吸入氣霧劑以3 mg·kg－1為起始劑量，以3倍劑量間距設(shè)置中、高劑量，對(duì)大鼠進(jìn)行連續(xù)3個(gè)月重復(fù)給藥的毒性試驗(yàn)[14]；格隆溴銨吸入粉霧劑以0.5 mg·kg－1為起始劑量，以9、10倍劑量間距設(shè)置中、高劑量，對(duì)大鼠進(jìn)行連續(xù)3個(gè)月的重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)[6]；阿地溴銨吸入粉霧劑則以0.006 mg·kg－1作為低劑量，以3.6、7.3倍劑量間距設(shè)置中、高劑量，對(duì)Beagle犬進(jìn)行6個(gè)月的重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)[15]。

2.3.2 氣溶膠濃度對(duì)給藥劑量的影響 氣溶膠濃度與受試物的理化性質(zhì)（濃度、黏度等）、霧化氣流量（包括氣流速度和壓力，主要針對(duì)霧化用吸入溶液）等相關(guān)。吸入給藥時(shí)氣溶膠濃度的表示方式眾多，包括了名義濃度、理論濃度、實(shí)際濃度，OECD對(duì)液體和固體型氣溶膠濃度的允許偏差為±20%[10]。在進(jìn)行吸入制劑的非臨床研究時(shí)，實(shí)際濃度（以有效成分計(jì)算）是主要的氣溶膠濃度表示方式，可通過(guò)不同的手段進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于液體制劑（氣霧劑和吸入溶液，通常為混合物，常含有溶劑、pH調(diào)節(jié)劑、促滲劑等），通常可采用高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）等分析手段進(jìn)行檢測(cè)，以反映有效成分的含量。對(duì)于無(wú)揮發(fā)性的單一化合物（如粉霧劑），可考慮直接采用稱重法進(jìn)行氣溶膠濃度的檢測(cè)。

2.3.3 通氣量和氣流量對(duì)給藥劑量的影響 吸入給藥劑量根據(jù)固定的換算公式進(jìn)行計(jì)算，常用的計(jì)算公式為D＝（C×RMV×T）/BW，其中D為給藥劑量，C為暴露口處的氣溶膠濃度，RMV為動(dòng)物的每分鐘通氣量，T為吸入給藥時(shí)長(zhǎng)。RMV通常以健康動(dòng)物的平均每分鐘通氣量進(jìn)行代入計(jì)算，因此吸入給藥劑量屬于較為粗略的計(jì)算公式，動(dòng)物的每分鐘通氣量和動(dòng)物健康狀態(tài)直接相關(guān)，對(duì)于有呼吸道毒性的藥物，可適當(dāng)考慮實(shí)際通氣量與理論通氣量的差異對(duì)吸入給藥劑量的影響。

霧化氣流量除了可用于形成氣溶膠外，還可用來(lái)提供動(dòng)物在吸入給藥時(shí)的氧氣，故氣流量不應(yīng)低于所有動(dòng)物的每分鐘通氣量之和，通常至少設(shè)置為其的2倍以上，在此基礎(chǔ)上，可通過(guò)調(diào)整霧化氣流量的大小來(lái)獲得不同濃度的氣溶膠。但氣流量也不宜過(guò)大，任俊明等[16]研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)2 h對(duì)大鼠進(jìn)行2倍潮氣量的機(jī)械通氣，可導(dǎo)致大鼠形成明顯的肺臟損傷。不同劑量組間，等給藥時(shí)長(zhǎng)（劑量組間濃度不相同）、不等給藥時(shí)長(zhǎng)（劑量組間濃度相同）是較常見的給藥方式，兩種給藥方式均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。其中等給藥時(shí)長(zhǎng)可以排除不同保定時(shí)長(zhǎng)對(duì)動(dòng)物的影響，但因不同濃度氣溶膠之間的粒徑差異，可能導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)一定偏差。不等給藥時(shí)長(zhǎng)（劑量組間濃度相同）克服了氣溶膠濃度對(duì)粒徑的影響，但在需長(zhǎng)時(shí)間保定來(lái)進(jìn)行吸入給藥的研究中，易出現(xiàn)因動(dòng)物保定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)所導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果（如體重降低、活動(dòng)減少等）。

2.3.4 氣溶膠粒徑對(duì)給藥劑量的影響 粒徑分布影響著吸入制劑氣溶膠在呼吸道不同部位的沉積量。Winkler等[17]采用小鼠氣道模型模擬顆粒物在人呼吸道的沉積作用，發(fā)現(xiàn)小于3 μm的顆粒主要沉積在肺部，肺臟沉積量隨著顆粒物直徑增大而減少，而對(duì)于粒徑大于3 μm的顆粒，氣道濾過(guò)作用將顆粒物大部分截留在上呼吸道。Kuehl等[18]則分別通過(guò)SPECT/CT對(duì)99mTc標(biāo)記的0.5、1.0、3.0、5.0 μm的氣溶膠顆粒進(jìn)行示蹤，以考察不同粒徑大小的氣溶膠顆粒在肺內(nèi)的分布差異。結(jié)果顯示，小鼠與大鼠體內(nèi)的沉積比例隨著氣溶膠粒徑的減小而升高，其中肺內(nèi)沉積量主要以1.0～5.0 μm的氣溶膠為主。通常5～10 μm的氣溶膠主要沉積于咽、喉部；3～5 μm的氣溶膠主要沉積于肺部；小于3 μm的氣溶膠則有50%～60%沉積于肺泡，能實(shí)現(xiàn)被動(dòng)的肺泡靶向目的[19]；另外，小于2.5 μm的氣溶膠則因過(guò)多的肺部沉積，而難以發(fā)揮針對(duì)支氣管的藥效作用，同時(shí)導(dǎo)致系統(tǒng)毒性風(fēng)險(xiǎn)增加[19]。氣溶膠的粒徑分布反映的是不同粒徑大小的氣溶膠所占的百分比，在進(jìn)行藥物安全性評(píng)價(jià)時(shí)，可將給藥劑量換算為呼吸道沉積劑量，考察實(shí)際作用劑量[20]，以更精確地反映呼吸道不同水平的毒性反應(yīng)與給藥劑量的關(guān)系。如福莫特羅粉霧劑的一般毒性研究中，除了表征受試物的吸入劑量以外，還根據(jù)氣溶膠的粒徑分布特性考察了氣道的實(shí)際沉積量，最終得到大鼠連續(xù)6個(gè)月吸入給藥的實(shí)際最大無(wú)毒性劑量（no observed adverse effect level，NOAEL）約為6.3 mg·kg－1，僅為吸入給藥劑量的0.17倍[15]。

2.4 吸入給藥的質(zhì)量控制

吸入給藥時(shí)的質(zhì)量控制是保證動(dòng)物給藥量準(zhǔn)確的重要手段，它是通過(guò)一系列的驗(yàn)證性試驗(yàn)來(lái)證明吸入制劑經(jīng)霧化后形成的氣溶膠濃度是穩(wěn)定和均一的，其目的是確保吸入給藥的批內(nèi)和批間（同組內(nèi)不同動(dòng)物之間以及相同動(dòng)物不同給藥時(shí)間點(diǎn)之間）劑量的一致性。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)此項(xiàng)研究的報(bào)道較少，雖然OECD對(duì)其合格標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了約定，即不同暴露通道之間的氣溶膠濃度差異應(yīng)在平均氣溶膠濃度的±20%范圍內(nèi)（針對(duì)液體和固體型氣溶膠），但各國(guó)的監(jiān)管部門并未出臺(tái)相應(yīng)的指導(dǎo)原則來(lái)對(duì)質(zhì)量控制的驗(yàn)證方法進(jìn)行約定。目前各個(gè)研究單位對(duì)質(zhì)量控制的驗(yàn)證方法的內(nèi)容大致相似，主要包括氣溶膠采樣方式驗(yàn)證、霧化氣溶膠的濃度均一性和穩(wěn)定性驗(yàn)證、氣溶膠的粒徑均一性和穩(wěn)定性驗(yàn)證、其他相關(guān)驗(yàn)證。

2.4.1 氣溶膠采樣方式驗(yàn)證 氣溶膠的采樣方式包括多種，如濾膜采樣、采樣瓶采樣、吸收袋采樣等[21]。其中濾膜采樣的驗(yàn)證內(nèi)容主要包括濾膜材質(zhì)的選擇和濾膜回收率的考察。濾膜的材質(zhì)需根據(jù)受試物氣溶膠理化性質(zhì)進(jìn)行選擇，常用的濾膜有玻璃纖維、石英纖維、聚四氟乙烯等[22-23]（見表1），其中以石英纖維和玻璃纖維濾膜使用頻率較多，孔徑多為0.22 μm，各種濾膜的使用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)性能詳見表1；同時(shí)應(yīng)對(duì)濾膜上受試物的回收率進(jìn)行考察，回收率的標(biāo)準(zhǔn)目前尚無(wú)指導(dǎo)原則和規(guī)范性文件進(jìn)行約束，多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道均在90%以上，以確保濾膜的批件差異不影響氣溶膠濃度的檢測(cè)。徐思琦等[24]對(duì)醋酸纖維濾膜和玻璃纖維濾膜進(jìn)行了加標(biāo)回收試驗(yàn)考察，結(jié)果顯示，氣溶膠中碘、溴的回收率均在92%～101%。

表1 不同采樣濾膜的性能及優(yōu)缺點(diǎn)Tab 1 Performance，advantages and disadvantages of different sampling filter membranes

采樣瓶采樣的驗(yàn)證內(nèi)容包括吸收液的種類和體積驗(yàn)證。吸收液種類需根據(jù)受試物的理化性質(zhì)進(jìn)行選擇，蛋白多肽類氣溶膠可選擇生理鹽水作為吸收液；小分子化合物則可根據(jù)受試物的分析方法選擇相應(yīng)的有機(jī)溶劑（流動(dòng)相）作為吸收液。吸收液的體積可根據(jù)采樣流量和采樣濃度進(jìn)行調(diào)整，氣溶膠流經(jīng)吸收液后，其總吸收效率應(yīng)不低于95%，其驗(yàn)證方法可通過(guò)串聯(lián)多級(jí)采樣瓶來(lái)實(shí)現(xiàn)。

2.4.2 霧化氣溶膠的濃度穩(wěn)定性和均一性驗(yàn)證臨床上吸入給藥常規(guī)的給藥時(shí)長(zhǎng)為15～30 min，但在非臨床研究階段，往往需通過(guò)延長(zhǎng)吸入時(shí)長(zhǎng)來(lái)達(dá)到增大暴露量的目的，因此霧化器產(chǎn)生穩(wěn)定濃度的氣溶膠的能力直接影響到了動(dòng)物在吸入給藥時(shí)的給藥劑量穩(wěn)定性。通常采用一段時(shí)間內(nèi)的霧化穩(wěn)定性考察，以支持正式試驗(yàn)中相應(yīng)時(shí)長(zhǎng)的連續(xù)給藥。同時(shí)可通過(guò)重復(fù)至少3個(gè)批次的穩(wěn)定性驗(yàn)證，以考察霧化器重復(fù)多次霧化的批間差異。顆粒物的沉降導(dǎo)致不同位置氣溶膠濃度的差異[25-29]，霧化均一性驗(yàn)證是考察不同位置（暴露口，尤其是上、中、下層）的氣溶膠濃度差異，用于支持多只動(dòng)物的批量性吸入給藥。

2.4.3 粒徑穩(wěn)定性和均一性驗(yàn)證 影響氣溶膠粒徑分布的因素包括化學(xué)成分（尤其是液體吸入制劑，如溶劑、活性成分等，會(huì)因黏度、吸附和聚集性等影響粒徑）[30]、霧化氣流量（或壓力）[31-32]、溫濕度、顆粒運(yùn)動(dòng)（如沉降）等，對(duì)不同濃度的氣溶膠進(jìn)行粒徑的穩(wěn)定性和均一性驗(yàn)證可減少粒徑分布的波動(dòng)。目前暫無(wú)相關(guān)指導(dǎo)原則或法規(guī)性文件約定粒徑分布的驗(yàn)證頻率及方法，伴隨在氣溶膠濃度的穩(wěn)定性和均一性驗(yàn)證過(guò)程中開展一定程度的粒徑分布考察，對(duì)霧化器的選擇、藥效結(jié)果以及安全性風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)具有一定作用。

2.4.4 其他驗(yàn)證 其他驗(yàn)證還包括吸入儀器的清洗驗(yàn)證等，通過(guò)對(duì)吸入暴露系統(tǒng)各儀器部件的清洗方法進(jìn)行考察，以確保清洗徹底，并能減少不同劑量組間交叉污染的可能性。

2.5 檢測(cè)指標(biāo)

2.5.1 肺功能檢查 肺功能檢查提供了一系列能反映受試物對(duì)呼吸系統(tǒng)生理狀態(tài)影響的客觀指標(biāo)，包括呼吸功能和非呼吸功能檢測(cè)，其中呼吸功能可包括通氣功能、換氣功能、小氣道功能、氣道阻力和肺順應(yīng)性、呼吸動(dòng)力學(xué)以及氣道反應(yīng)性等[33-39]，非呼吸功能參數(shù)主要針對(duì)呼吸系統(tǒng)的生物活性物質(zhì)的代謝，包括肺泡灌洗液和肺臟中的細(xì)胞因子、總蛋白和乳酸脫氫酶含量、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類以及免疫細(xì)胞分型等[40-43]。

2.5.2 常規(guī)病理染色 吸入制劑的安全性評(píng)價(jià)較常規(guī)給藥途徑有諸多特殊考慮點(diǎn)，與常規(guī)給藥途徑的一般毒理學(xué)試驗(yàn)比較，呼吸系統(tǒng)的安全性是重點(diǎn)考察對(duì)象，通常需對(duì)呼吸系統(tǒng)進(jìn)行多個(gè)組織水平的考察[44-45]，以評(píng)價(jià)不同粒徑分布的氣溶膠對(duì)呼吸系統(tǒng)的影響（見表2）。吸入給藥的檢查器官較常規(guī)給藥途徑增加了嗅球、舌、鼻咽部、喉部、胸膜、肺門淋巴結(jié)和眼瞼的檢查，同時(shí)在鼻咽部需進(jìn)行四水平的檢查，確保能觀察到鱗狀上皮、移行上皮、呼吸上皮和嗅上皮以及鼻淋巴結(jié)；喉部則需進(jìn)行三水平的檢查；肺臟和肺門淋巴結(jié)通常合并在一起進(jìn)行檢查，并需進(jìn)行三水平的考察。另外眼瞼等與受試物有頻繁接觸的部位也應(yīng)進(jìn)行重點(diǎn)考察。格隆溴銨粉霧劑[6]和阿福莫特羅吸入氣霧劑[46]均通過(guò)對(duì)呼吸系統(tǒng)進(jìn)行多組織器官和多水平的考察，來(lái)評(píng)估其呼吸系統(tǒng)的安全性風(fēng)險(xiǎn)。其中格隆溴銨能引起鼻腔和鼻竇嗜酸性細(xì)胞的聚集、上皮細(xì)胞脫落、杯狀細(xì)胞肥大；喉上皮生化和鱗狀上皮生化；支氣管肺泡連接處細(xì)胞肥大等。阿福莫特羅吸入氣霧劑則主要引起肺臟的炎癥細(xì)胞聚集。

表2 吸入給藥和非吸入給藥的一般毒性試驗(yàn)中呼吸系統(tǒng)組織病理學(xué)檢查要求的比較Tab 2 Histopathological examination requirements of the respiratory system for inhaled and non-inhaled drugs in general toxicity test

2.5.3 特殊病理染色 特殊染色能反映肺臟的特異性病理改變，如肺內(nèi)異物沉積（如難溶性藥物、粉塵等），導(dǎo)致巨噬細(xì)胞吞噬和裂解，釋放磷脂等肺泡表面活性物質(zhì)以及肺泡液體內(nèi)的其他蛋白結(jié)合物，則會(huì)表現(xiàn)為PAS染色陽(yáng)性[47]；Masson染色則能反映肺臟的膠原沉積和纖維化病變程度[48]。

2.6 恢復(fù)期的設(shè)置

吸入給藥的恢復(fù)期設(shè)置應(yīng)結(jié)合藥物對(duì)呼吸系統(tǒng)的毒性作用的可逆性以及藥物在肺部的清除動(dòng)力學(xué)進(jìn)行設(shè)置，通常易溶性藥物具有較快的清除過(guò)程，其清除方式主要為溶解和擴(kuò)散[19]；難溶性藥物的清除過(guò)程較慢，易在肺部沉積，其清除過(guò)程以巨噬細(xì)胞的吞噬和纖毛外排[49-51]，且吞噬速度具有顯著的粒徑依賴性，粒徑越小，吞噬速度越慢，故通常需設(shè)置至少2個(gè)停藥恢復(fù)期，以考察受試物在肺內(nèi)的清除動(dòng)力學(xué)[52]。謝赫然[53]考察炭黑在肺部的吸收、沉積和消除過(guò)程的結(jié)果顯示，連續(xù)28 d吸入炭黑染毒，可見大量炭黑沉積于肺間質(zhì)，少量沉積于肺泡間，停止染毒14 d后，肺內(nèi)炭黑清理率僅為27.5%，且恢復(fù)期和給藥期的肺臟病理變化類型相同，程度相似，提示14 d的恢復(fù)期不足以反映肺臟清除的可逆性。

3 吸入給藥安全性評(píng)價(jià)的結(jié)果分析

吸入給藥的安全性評(píng)估需對(duì)受試物毒性作用的臨床意義進(jìn)行甄別，例如格隆溴銨粉霧劑[6]的一般毒性研究中可見鼻腔和鼻竇嗜酸性細(xì)胞的聚集、上皮細(xì)胞脫落、杯狀細(xì)胞肥大，但因粉霧劑在臨床應(yīng)用是主要通過(guò)口腔吸入給藥，鼻腔（包括鼻甲等部位）與藥物基本無(wú)接觸，故在非臨床研究階段的毒性發(fā)現(xiàn)雖有生物學(xué)意義，但其臨床意義不大。另外，大鼠與人在鼻腔、咽喉部解剖結(jié)構(gòu)的差異同樣會(huì)對(duì)受試物毒性反應(yīng)的臨床意義評(píng)估造成影響，需仔細(xì)辨別。

4 總結(jié)與展望

吸入制劑是一類藥械組合的特殊制劑，屬于近年來(lái)發(fā)展較快的新興劑型之一，在非臨床研究階段除了自身的器械（如霧化機(jī)、噴霧瓶等）外，還需引入額外的給藥系統(tǒng)（大、小動(dòng)物吸入染毒系統(tǒng)），以達(dá)到動(dòng)物吸入給藥的目的。吸入制劑非臨床研究?jī)?nèi)容的選擇應(yīng)考慮研發(fā)目的、氣溶膠的粒徑分布和其他理化性質(zhì)，同時(shí)試驗(yàn)設(shè)計(jì)需綜合考慮給藥時(shí)長(zhǎng)、給藥濃度對(duì)暴露劑量的影響。吸入給藥劑量的確定是吸入制劑進(jìn)行非臨床評(píng)價(jià)的難點(diǎn)之一，氣溶膠的粒徑分布特性決定其在呼吸道的沉積位置以及沉積劑量，多種數(shù)學(xué)模型[如多路徑粒子劑量測(cè)定模型（multiple path particle dosimetry models，MPPD）、生理基礎(chǔ)藥代動(dòng)力學(xué) 模 型（physiologically based pharmacokinetic，PBPK）等[54]]均可作為氣溶膠的特性與肺沉積量的關(guān)系研究提供了多樣性的工具和手段。如何將吸入給藥劑量與臨床給藥量進(jìn)行橋接是將吸入制劑進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)換需解決的重要問(wèn)題之一。我國(guó)針對(duì)吸入給藥的非臨床研究指導(dǎo)原則幾乎沒有，且針對(duì)吸入給藥安全性評(píng)價(jià)過(guò)程中的關(guān)鍵點(diǎn)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)尚未形成統(tǒng)一的共識(shí)，尤其是針對(duì)吸入給藥過(guò)程中的質(zhì)量控制方法及合格標(biāo)準(zhǔn)尚無(wú)相應(yīng)的指導(dǎo)性文件作為支持，這也為吸入給藥的安全性評(píng)價(jià)帶來(lái)了一定的挑戰(zhàn)，同時(shí)也制約了國(guó)內(nèi)吸入制劑非臨床評(píng)價(jià)工作的開展和吸入制劑的新藥研發(fā)。本文根據(jù)文獻(xiàn)資料、吸入制劑申報(bào)資料和自身研究經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行了一些關(guān)鍵點(diǎn)的總結(jié)，以期為吸入制劑非臨床評(píng)價(jià)的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化提供參考。