洋丁香提取工藝及其凝膠劑制備工藝的優化

田其健，包旭宏，姜墾，朱建英（.甘肅中醫藥大學，蘭州 730000；.甘肅奇正藏藥有限公司，蘭州 730000）

洋丁香（Syringa vulgarisL.）為木犀科丁香屬植物洋丁香的干燥葉片，又稱“歐丁香”，為中藥丁香葉藥材來源之一。洋丁香原產東南歐，在我國分布廣泛，東北、華北、西北各省及江蘇等地均有種植，具有觀賞、環境美化和藥用等多種用途，是庭院綠化的主要樹種之一。其性寒、味苦，歸肺、胃經，具有清熱解毒、消炎止痢、保肝利膽等功效。民間用其水煎液治療痢疾和暴發火眼，外敷皮膚用于止癢。現代研究表明，洋丁香所含化學成分主要有倍半萜類、環烯醚萜類、木脂素類、三萜類、黃酮類、苯丙素類、苯乙醇類等。其中紫丁香苷具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、鎮痛[1-4]等作用，酪醇具有抗炎、抗腫瘤、免疫調節、保護神經和心血管等作用[5-8]。

凝膠劑是一種藥物與適當基質制成的具有凝膠特性的稠厚液體或半固體制劑。將傳統中藥制劑處方和凝膠劑制備技術相結合所制備的中藥凝膠劑不僅可以容納中藥提取物，也可以容納中藥材極細粉，具有工藝簡單、使用方便、易于清洗等優點，是一種良好的藥用劑型，具有廣闊的發展前景[9]。本試驗采用響應面與正交試驗法優選洋丁香的提取及其凝膠劑的制備工藝，以期為洋丁香的進一步開發利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

數顯恒溫電熱套（SKM，菏澤市博奧儀器有限公司）；旋轉蒸發儀（R-3，瑞士步琦有限公司）；循環水式多用真空泵（SHZ-95B，上海予華儀器設備有限公司）；低溫冷卻液循環泵（DLSB-5/20，鄭州長城科工貿有限公司）；立式超純水機（MOLgene120d，甘肅摩勒科學有限公司）；超聲波清洗儀（BK8200HP，上海科導超聲儀器有限公司）；電子天平（YP-2001N，上海精密科學儀器有限公司）；分析天平[XS205DU，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；電熱鼓風干燥箱（101A-3B，上海實驗儀器廠有限公司）；高效液相色譜儀[Agilent 1260，安捷倫科技（中國）有限公司]；電動攪拌器（R-30，上海弗魯克科技發展有限公司）。

1.2 試藥

紫丁香苷對照品（批號：111574-201605，純度：95.2%）、酪醇對照品（批號：111676-200602，純度≥98.0%）（中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（成都科隆化學品有限公司）；卡波姆940（河北固安希星藥業有限公司）；丙二醇（湖南爾康制藥股份有限公司）；丙三醇（天津河東區紅巖試劑廠）；三乙醇胺（天津百世化工有限公司）；純水為自制。洋丁香葉摘自蘭州市城關區南河道，經甘肅中醫藥大學晉玲教授鑒定為洋丁香。洋丁香葉片篩去雜質，洗凈后曬干，陰涼通風處保存備用。

2 方法與結果

2.1 藥材吸水率測定

稱取洋丁香藥材5 g，加足量水浸泡，每隔10 min觀察藥材是否浸透，稱重，計算吸水率。吸水率（%）＝（藥材濕重－5）/5×100%。吸水率曲線見圖1。由圖1可知，藥材40 min時幾乎吸水完全，此時吸水率為324.60%，約為自身重量3倍。因此后續煎煮時加水量應減為第1次加水量的1/3。

圖1 藥材吸水率曲線Fig 1 Water absorption curve

2.2 出膏率測定

取洋丁香藥材30 g，加水適量，經回流提取獲得水煎液，減壓濃縮至50 mL取10 mL于已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干后于105℃干燥至恒重。干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質量，計算出膏率。出膏率（%）＝（含干膏蒸發皿質量－蒸發皿質量）×5/30×100%。

2.3 紫丁香苷、酪醇含量測定

2.3.1 對照品溶液的配制 精密稱取紫丁香苷對照品8.3 mg、酪醇對照品10.7 mg分別置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲處理10 min，作為紫丁香苷、酪醇對照品儲備液。精密量取紫丁香苷、酪醇對照品儲備液0.5、1、2、4、6 mL于10 mL量瓶中，定容，制成分別含紫丁香苷15.8、31.6、63.2、126.4、189.6 μg·mL－1紫丁香苷對照品（經折算后）與分別含酪醇21.42、42.84、85.68、171.36、257.04 μg·mL－1的酪醇對照品溶液，4℃儲藏，備用。

2.3.2 色譜條件

① 紫丁香苷：色譜柱為Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動相為甲醇（A）-0.1%磷酸水（B）（18∶82）；流速為1.0 mL·min－1；柱溫為25℃；檢測波長為265 nm；進樣量為10 μL。理論塔板數按紫丁香苷峰計算應不低于3000。

② 酪醇：色譜柱為Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動相為甲醇（A）-0.1%磷酸水（B）（15∶85）；流速為1.0 mL·min－1；柱溫為25℃，檢測波長為275 nm；進樣量為10 μL。理論塔板數按酪醇峰計算應不低于3000。

2.3.3 供試品溶液的制備

① 紫丁香苷：取洋丁香藥材30 g于500 mL圓底燒瓶中，精密加入300 mL水，回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液，減壓濃縮至50 mL，精密量取1 mL，10%乙醇稀釋2倍，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

② 酪醇：取上述濃縮液1 mL于5 mL量瓶中定容，2倍量乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，水浴揮干，2 mL甲醇溶解，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.4 標準曲線的繪制 分別精密吸取“2.3.1”項下對照品溶液進樣測定，以色譜峰面積對進樣量進行線性回歸，繪制標準曲線，得紫丁香苷回歸方程：y＝21.98x＋13.30，R2＝0.9999，線性范圍為15.8～189.6 μg·mL－1；得到酪醇回歸方程：y＝6.33x－3.85，R2＝1.000，線性范圍為21.42～257.04 μg·mL－1。

2.3.5 精密度試驗 分別精密吸取“2.3.1”項下126.4 μg·mL－1的紫丁香苷與171.36 μg·mL－1的酪醇對照品溶液，連續進樣6次。分別計算紫丁香苷、酪醇峰面積的RSD，結果分別為0.69%與0.56%。

2.3.6 穩定性試驗 分別精密稱取“2.3.3”項下供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h后進樣分析。結果紫丁香苷、酪醇峰面積的RSD分別為1.1%和1.5%。

2.3.7 重復性試驗 按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液6份，進樣測定。結果紫丁香苷與酪醇峰面積的RSD分別為0.92%和0.31%。

2.3.8 加樣回收試驗 取已知含量的供試品溶液3份，分別加入紫丁香苷、酪醇對照品適量，進樣分析，計算得供試品在低、中、高濃度下紫丁香苷的平均回收率分別為98.72%、96.37%與99.71%，RSD值分別為2.4%、1.3%與2.1%；酪醇平均回收率分別為102.06%、101.75%與98.87%，RSD值分別為4.1%、3.3%與2.7%（n＝3）。

2.4 提取工藝考察因素與評分方法

洋丁香民間常水煎后使用，因此對其水提工藝進行考察。根據預實驗結果，以出膏率、紫丁香苷和酪醇提取含量為指標綜合評分，選擇加液倍數、提取次數和提取時間為考察因素。采用層次分析法（AHP）進行分析，結合文獻報道與專家意見[10-11]，確定各指標的權重系數，判斷矩陣見表1。

表1 各指標權重的判斷矩陣Tab 1 Judgment matrix

采用AHP計算，最終確定出膏率、紫丁香苷、酪醇的權重系數分別為0.4、0.3和0.3。根據權重系數計算綜合評分Y（%）＝出膏率/出膏率最大值×0.4＋紫丁香苷含量/紫丁香苷含量最大值×0.3＋酪醇含量/酪醇含量達最大值×0.3。

2.5 單因素考察洋丁香提取工藝

稱取藥材30 g，固定其他條件不變，分別考察加液倍數、提取時間、提取次數、浸泡時間對洋丁香提取工藝的影響，結果見圖2，考慮實際操作，選擇加液10倍、每次提取1.5 h、提取2次作為響應面法的考察水平。

圖2 洋丁香HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of syringa vulgaris L.

圖3 單因素試驗結果Fig 3 Single factor test

2.6 洋丁香提取工藝的優選

結合單因素試驗結果，采用Box-Behnken響應面試驗設計，選擇提取時間、加液倍數與提取次數為考察因素。因素與水平見表2。以出膏率與紫丁香苷、酪醇含量為考察指標，按照Box-Behnken響應面設計進行試驗見表3、圖4，方差分析結果見表4。

圖4 3種因素對綜合評分的響應面圖Fig 4 Response surface plot of 3 factors on comprehensive scoring

表2 因素水平表Tab 2 Factor and level

表3 試驗設計與結果Tab 3 Design and results

表4 方差分析結果Tab 4 Variance analysis

由表4可知，失擬項P值＞0.05表明該模型擬合度較好，可信度較高，可用該模型優化制備工藝。

采用Design-expert 8.0.6軟件對試驗結果進行分析，得到綜合評分（Y）對提取時間（A）、提取次數（B）、加液倍數（C）的回歸方程為Y＝－151.45＋39.41A＋61.60B＋24.71C＋0.28AB＋1.10AC－0.91BC－16.39A2－10.10B2－1.18C2。由表可知各項影響因素對模型的影響程度為提取次數＞加液倍數＞提取時間，通過對回歸模型的極值分析可以得到最優條件為提取1.57 h，提取2.61次，加液10.17倍，此時Y的預測值為85.52%。結合生產實際操作，將最優提取條件調整為加液10倍，提取2次，每次1.5 h。

根據上述優化的提取工藝參數分別提取3份藥材，結果顯示3份藥材Y平均值為82.62%，（RSD＝1.5%，n＝3），與預測值81.54%相對誤差為0.51%，說明該模型預測性擬合度良好，所得數據可靠。

2.7 凝膠劑的制備

2.7.1 基質篩選 本試驗主藥為洋丁香水提取物，結合文獻[10-14]，選擇卡波姆940為凝膠劑基質，甘油和丙二醇為常用保濕劑，三乙醇胺為pH調節劑，采用正交試驗設計，以凝膠劑的外觀性狀、涂展性、耐熱穩定性、耐寒穩定性和離心穩定性的綜合評分為指標篩選洋丁香凝膠劑中各輔料的最佳用量。

2.7.2 有效成分的提取 照上述篩選的最佳提取工藝稱取洋丁香藥材30 g，在圓底燒瓶中加入300 mL水，回流提取2次，每次1.5 h，合并水煎液并濃縮至30 mL（密度約為1.0），冷卻，放入4℃冰箱保存備用。

2.7.3 凝膠劑的制備 稱取處方量的凝膠劑基質均勻撒在適量蒸餾水的表面，靜置溶脹過夜。將甘油、丙二醇加入中藥中攪拌均勻后將其加入凝膠劑基質中混勻。加入處方量三乙醇胺，加蒸餾水至100 g，400 r·min－1攪拌均勻即可。

2.7.4 質量檢查 對凝膠劑進行外觀性狀、涂展性、耐熱[9]、耐寒和離心穩定性檢查，并對其進行打分評價。滿分為10分，評分標準如表5所示。

表5 評分標準Tab 5 Standard for evaluation

2.7.5 正交試驗設計 根據前期試驗制訂因素水平見表6。

表6 因素水平表Tab 6 Factor and level

2.7.6 試驗結果 按照正交設計進行試驗。按照表5設定的評分標準進行評價，結果見表7。方差分析結果見表8。由表8可以看出，各因素影響順序為卡波姆940＞三乙醇胺＞甘油＞丙二醇，結合實際情況，綜合考慮選擇工藝為每100 g凝膠劑中卡波姆940為1.5%，丙二醇10%，甘油5%，三乙醇胺1.5%。凝膠劑成型效果見圖5。

圖5 凝膠劑產品圖Fig 5 Product drawing of gel

表7 試驗設計與結果Tab 7 Design and results of trials

表8 方差分析結果Tab 8 Variance analysis

按照處方最佳組合制備3批凝膠劑，結果制備的凝膠劑外觀細膩均勻，涂展性與穩定性良好，平均評分為9.2分，見表9。

表9 處方驗證評分(分)Tab 9 Prescription verification score (score)

3 討論

本試驗通過響應面法對洋丁香傳統提取方式進行了優化，篩選出最佳水提條件，可為其后續制劑生產提供參考。

洋丁香入藥具有清熱解毒、抗菌消炎等功效，民間常用其水煎液內服治療細菌性痢疾，熱敷外用于皮膚瘙癢等癥。研究發現洋丁香葉中含有的環烯醚萜類、黃酮類成分具有一定的抗炎、抗菌藥理活性[15]。凝膠劑制法簡單，使用方便、舒適，能夠較長時間黏附于作用部位，因此本試驗將洋丁香提取物制備成中藥凝膠制劑以便于皮膚外用。凝膠劑的基質常分為水性與油性，結合提取物性質，本試驗選擇了水性基質為藥物載體。通過正交試驗對卡波姆940、丙二醇、甘油與三乙醇胺進行處方篩選，最優處方制得的中藥凝膠劑外觀性狀、涂展性和穩定性表現良好，其工藝操作簡單，穩定可行。后期試驗將對其藥效、藥理及質量標準等內容進行完善，以期為開發該中藥凝膠制劑與進一步應用于臨床提供依據。