雙石清熱合劑中6種有效成分的含量測定及提取工藝優化

王隆隆，張海風，楊忠杰，劉菊，黃霞，于曉濤，王瑞*（.漯河市中心醫院，河南 漯河 4600；.鄭州市中醫院，鄭州 450000；.河南省食品藥品檢驗所，鄭州 450000）

雙石清熱合劑是本院中醫科醫師在長期臨床實踐中以《銀翹散》為基礎加減裁化所得的臨床驗方，由金銀花、黃芩、知母等14味中藥組成，主要用于熱毒壅盛所致發熱面赤、口渴、頭昏、喉腫等癥。方中以金銀花為君藥，具有清熱解毒、疏散風熱功效；以黃芩、知母為臣藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒、滋陰潤燥的功效；佐以梔子，清瀉三焦火熱、涼血解毒[1]。金銀花、梔子、知母、黃芩等中藥具有抗菌、抗炎、抗病毒、解熱及增強機體免疫功能等作用[2-3]，該方常用于肺胃實熱、口舌生瘡、牙齦腫痛及上呼吸道感染等[4]。

本文選取金銀花、黃芩、知母、梔子和牛蒡子為研究對象，建立合適的HPLC法同時測定綠原酸、梔子苷、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷6種指標成分的含量。目前，雙石清熱合劑的制備是傳統的煎藥經驗，并未進行系統性工藝研究，為了保證藥品質量和療效，本文通過Box-Behnken響應面法優化其提取工藝，更全面地保證了藥品質量，確保了患者用藥的安全性、有效性和穩定性[5]。

1 材料

1.1 中藥飲片

中藥飲片金銀花（批號：190801）、蟬蛻（批號：191101）、生石膏（批號：191001）、連翹（批號：190201）、大青葉（批號：190401）、黃芩（批號：190901）、龍膽（批號：191101）、梔子（批號：190701）、玄參（批號：190801）、麥冬（批號：190501）、知母（批號：291101）（河南鴻博藥業有限公司）；牛蒡子（批號：1708100017）、紫花地丁（批號：1710120037）、地黃（批號：1712230127）（亳州天濟藥業有限公司），由鄭州大學藥學院賈陸教授鑒定為金銀花（Lonicera japonicaThunb.）、蟬蛻（Cryptotympana pustulataFabricius）、生石膏（Gypsum Fibrosuum）、連翹[Forsythia suspensa（Thunb.）Vah]、大青葉（Isatis indigoticaFort.）、黃芩（Scutellaria baicalensisGeorgi）、龍膽（Gentiana scabraBge.）、梔子（Ganiema Ellis）、玄參（Scrophularia ningpoensisHemsl）、麥 冬[Ophiopogon japonicus（L.f）Ker-GawL]、知母（Anemarrhena asphodeloidesBunge）、牛蒡子（Arctiumm lappa.）、紫花地丁（Viok yedoensisMakino）、地黃（Rehmannia glutinosaLibosch.），均為合格飲片。

1.2 試藥

對照品綠原酸（批號：110753-201817，純度：96.8%）、梔子苷（批號：110749-201718，純度：97.6%）、芒果苷（批號：111607-201704，純度：98.1%）、黃芩苷（批號：110715-201821，純度：95.4%）、牛蒡苷（批號：110819-201812，純度：95.0%）、漢黃芩苷（批號：112002-201702，純度：98.5%）（中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、甲醇均為色譜純（美國Fisher公司）；甲酸為色譜純（天津科密歐化學試劑有限公司）；其余試劑為市售分析純；水為飲用水或超純水。

1.3 儀器

島津LC-20AD高效液相色譜儀（包括二元泵、全波長紫外檢測器、柱溫箱、自動進樣器、工作站）；DHG-9070型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；SB25-12D超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）；FW-80型微型高速萬能試樣粉碎機（天津市工興電器廠）；AUW-120D型十萬分之一電子天平（日本SHIMADZU公司）；5810R高速離心機（美國Eppendorf公司）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）。

2 方法

2.1 色譜條件

采用色譜柱為Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以0.5%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～20 min，8%B；20～50 min，8%～15%B；50～90 min，15%～35%B；90～100 min，35%～80%B；100～110 min，80%B；110～112 min，80%～8%B；112～120 min，8%B）；柱溫30℃；進樣量10 μL；流速0.8 mL·min－1，檢測波長239 nm[6-7]。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取綠原酸、梔子苷、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷對照品適量，分別加甲醇制成質量濃度為1.86、2.00、1.89、2.02、2.14、2.03 mg·mL－1的對照品儲備液；精密量取上述各對照品儲備液適量，混勻，制得質量濃度分別為127.77、166.02、36.05、826.41、113.72、295.52 μg·mL－1的混合對照品溶液，密封保存。

2.3 供試品溶液制備

按處方稱取6份藥材飲片，按照原工藝方法（加水8倍，煎煮2次，每次1.5 h，濃縮至500 mL）制備，取樣品10 mL，置于50 mL具塞錐形瓶中，加甲醇10 mL，超聲1 h，冷卻后室溫稱重，用50%甲醇補足失重，13 000 r·min－1離心3 min，取上清液為供試品溶液。

2.4 陰性樣品溶液制備

按照雙石清熱合劑處方比例分別稱取缺金銀花、梔子、知母、黃芩、牛蒡子的5份處方藥材，依據“2.3”項下方法制得陰性樣品溶液[8]。

2.5 專屬性考察

按“2.1”項下色譜條件對混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液進行分析，結果如圖1所示，陰性樣品無干擾，且分離度均超過1.5，表明該色譜方法分離效果良好。

圖1 雙石清熱合劑高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of Shuangshi Qingre mixture

2.6 線性關系考察

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液100、200、400、600、800、1000 μL，分別置于1 mL量瓶中，用甲醇定容，制成系列質量濃度對照品溶液。進樣測定，以各待測成分進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，以S/N約為3時計算檢測限，以S/N約為10時計算定量限，結果見表1。

表1 各化學成分的回歸方程、相關系數、線性范圍、定量限及檢測限Tab 1 Regression equation，correlation coefficient，linearity，LOQs and LODs of components

2.7 精密度試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液，連續進樣6次，記錄峰面積。結果顯示綠原酸、梔子苷、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷峰面積的RSD為0.81%、0.50%、0.32%、0.54%、0.65%、1.3%，表明儀器的精密度良好。

2.8 重復性試驗

按處方比例稱取6份各藥材飲片，按照原工藝方法制備6份溶液，并按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定各成分含量。結果綠原酸、梔子苷、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、黃芩苷的RSD分別為1.8%、1.6%、0.79%、2.3%、1.0%、1.7%，表明該方法重復性良好。

2.9 穩定性試驗

取“2.3”項下供試品溶液，室溫下存放 0、6、12、24、48 h，進樣后測定，記錄各指標成分峰面積，計算RSD。結果顯示綠原酸、梔子苷、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷峰面積的RSD分別為2.4%、3.0%、0.99%、3.2%、1.3%、2.0%，表明樣品溶液在室溫條件下48 h內穩定。

2.10 加樣回收試驗

取“2.8”項下已知含量的供試品溶液1 mL，分別置于2 mL離心管中，精密加入“2.2”項下混合對照品溶液0.5、1、1.5 mL，進樣測定，計算出各成分含量和回收率。結果表明各成分平均回收率在98.7%～103.7%，RSD均＜5%，說明方法準確度良好。

2.11 樣品含量測定

取已知含量雙石清熱合劑3批（批號：20190903、20191209、20200203），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算3批樣品的含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果(μg·mL－1)Tab 2 Content determination in sample (μg·mL－1)

3 Box-Behnken響應面法試驗優化提取工藝

3.1 評分方法

由于經驗性加權評分方法容易主觀性干擾，本試驗根據6種指標成分的重要程度結合含量測定結果，采用SPSS軟件降維因子分析與“歸一法”相結合的評分方法[2，9]。結果顯示綠原酸、梔子苷、芒果苷、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷的權重系數分別為0.1921、0.0856、0.1101、0.2286、0.1749、0.2126，即綜合評分Y＝0.1921X1＋0.0856X2＋0.1101X3＋0.2286X4＋0.1749X5＋0.2126X6（X為指標成分）。

3.2 單因素試驗

① 吸水率試驗：按處方量比例稱取中藥飲片，考察藥材浸泡不同時間的吸水率（室溫約22℃），結果藥材浸泡40 min時吸水率達到17.5%，吸水較快；浸泡120 min時吸水率為24.3%，達到飽和。

② 加水量試驗：按處方量比例稱取中藥飲片，考察煎煮90 min，煎一次條件下不同加水量（4、6、8、10、12、14倍）的評分結果。

③ 煎煮時間試驗：按處方量比例稱取中藥飲片，考察加10倍量水，煎一次條件下不同煎煮時間（60、80、100、120 min）的評分結果。

④ 煎煮次數試驗：按處方量比例稱取中藥飲片，考察加10倍量水，煎100 min條件下不同煎煮次數（1、2、3、4次）的評分結果。

結果見圖2，根據單因素試驗結果，藥材吸水0.24倍，對實際影響較小，故本試驗采用浸泡40 min，加水量8、10、12倍，煎煮80、100、120 min，煎煮1、2、3次進行后續優化試驗。

圖2 單因素試驗Fig 2 Single-factor experiment

3.3 Box-Behnken響應面試驗優化提取工藝

3.3.1 Box-Behnken響應面試驗設計 在單因素試驗的基礎上，本試驗以加水量（A）、煎煮時間（B）、煎煮次數（C）為考察因素，采用Design-Expert v.8.0.6軟件，按照Box-Behnken響應面法設計原理，以6個成分指標的綜合得分為響應值，進行三因素三水平試驗設計。因素水平設計見表3，結果見表4[10]。

表3 因素與水平Tab 3 Factor and level

表4 響應面試驗設計方案與結果Tab 4 Design and result of the response surface test

3.3.2 模型結果分析 采用Design-Expert v.8.0.6軟件對表5的試驗數據進行二次多項式回歸擬合，得到綜合得分Y＝2.29＋0.024A＋0.044B＋0.22C－0.044AB＋0.018AC－0.020BC－0.04A2－0.091B2－0.15C2，結果見表5。

由表5可知，在回歸方程中一次項B、C，二次項B2、C2為顯著項（P＜0.05），交互項AB、AC、BC均不顯著（P＞0.05）；整體模型P＜0.05，表示該模型可以用于指標評分的分析和預測，且各指標對綜合評分的影響C（煎煮次數）＞B（煎煮時間）＞A（加水量）。采用Design-Expert v.8.0.6軟件繪制各影響因素的響應面圖，見圖3。由圖3可知交互因素BC＞AC＞AB。

圖3 各因素交互作用對綜合評分影響的響應面圖Fig 3 Response surface of the interaction of various factors on the comprehensive score

表5 方差分析結果Tab 5 Analysis of variance

3.4 最優結果的確定

采用Design-Expert v.8.0.6軟件預測的最佳工藝為加水10.66倍，煎煮101.62 min，煎煮2.73次，綜合評分2.379。根據單因素試驗及實際工藝要求，最終確定工藝為浸泡40 min，加水量為10倍量，煎煮3次，每次100 min。

3.5 驗證試驗

按處方比例稱取各中藥飲片，按照“3.4”項下工藝方法，平行進行3次試驗。按照“2.1”項下色譜方法同時測定6種成分含量，并計算出綜合評分。結果顯示3份樣品的綜合評分分別為2.357、2.337、2.399，與預測工藝綜合評分2.382偏差[偏差＝（最優值－預測值）/ 預測值×100%]分別為1.05%、1.89%、－0.71%，表明該提取方法實測值和預測值擬合較好，表明該工藝方法穩定可行。

4 討論

本試驗考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.5%磷酸、乙腈-0.5%甲酸幾種流動相搭配，最終確定了以乙腈-0.5%甲酸水溶液梯度洗脫進行雙石清熱合劑中6種有效成分測定，結果顯示各成分特征峰的分離度均高于1.5，且峰形較好。

本試驗根據單因素試驗結果，通過Design-Expert v.8.0.6軟件進行響應面試驗，選擇出了加10倍量水，浸泡40 min，煎煮3次，每次100 min為最佳工藝方法。該方法穩定、可靠，可作為該制劑的生產工藝。試驗發現不同工藝方法下梔子苷、黃芩苷的含量變化較大，而芒果苷、牛蒡苷含量變化相對較小；隨著煎煮時間的延長，綠原酸、梔子苷含量有下降趨勢，黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷含量有上升趨勢，該制劑的清熱，抗炎、抗病毒效果可能會隨煎煮時間的延長而改變[11-12]。

綜上所述，本文建立了測定6種有效成分的HPLC法，進一步利用Box-Behnken響應面法優化提取工藝，可有效地保證該制劑療效可控、質量穩定，確保患者用藥安全。本研究也為醫院新制劑的研發、生產、質控提供參考。