HS-GC-MS法分析醋香附揮發(fā)性化學(xué)成分

楊天歌，倪詩婷，高旭華，陶歐（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488）

香附為莎草科植物莎草（Cyperus RotundusL.）的干燥根莖，氣香，味辛、微苦、微甘，平；歸肝、脾、三焦經(jīng)；具有疏肝解郁、理氣寬中、調(diào)經(jīng)止痛的功效[1]；主要成分為揮發(fā)油類、黃酮類、糖類、生物堿類、酚類和三萜類化合物[2]。其揮發(fā)油類成分具有鎮(zhèn)痛、抗菌消炎、抑制子宮收縮、雌激素樣作用等[3-4]。關(guān)于香附揮發(fā)性成分已有較多研究并且普遍為提取揮發(fā)油后進(jìn)行GC-MS檢測，王艷等[5]建立了12批香附藥材揮發(fā)油的指紋圖譜，方蕾等藥理作用[6-7]參照揮發(fā)油測定法中的甲法結(jié)合GC-MS分別鑒定對比了藥對香附-藿香和陳皮-香附的揮發(fā)油，齊菲等[8]采用GC-MS法對比了隔水和共水蒸餾對香附揮發(fā)油提取的影響。香附醋炙后，能增強(qiáng)其疏肝止痛之功效[9]。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)醋香附成分研究有提取揮發(fā)油的GC-MS法和HPLC檢測等方法[10-11]。頂空進(jìn)樣（HS）-GC-MS法操作簡便、快速、經(jīng)濟(jì)安全、無需溶劑[12]。采用頂空進(jìn)樣法可避免揮發(fā)油長時間提取造成的易揮發(fā)成分的損耗，醋香附經(jīng)粉碎后即可裝樣測量，有利于節(jié)約時間，且直接氣體進(jìn)樣能夠更直觀地反應(yīng)醋香附氣味特征，為醋香附進(jìn)一步合理利用、質(zhì)量評價、香附與醋香附氣味對比提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

7697A HS-7890B GC-5977A MS 型頂空進(jìn)樣-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；BSA124S電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；FW200 高速萬能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）。

醋香附（北京市金象大藥房，批號：19112007，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王晶娟教授鑒定為莎草科植物莎草Cyperus rotundusL.的干燥根莖醋炙后的飲片）。

2 方法

2.1 樣品制備

將醋香附用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，過4號篩。稱取醋香附粉迅速裝入20 mL頂空進(jìn)樣瓶，加蓋密封，待測。以空瓶加蓋密封為空白對照。

2.2 儀器參數(shù)設(shè)置

GC條件：色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；樣口溫度為130℃，載氣為高純氦氣（純度＞99.999%）；流速為1.0 mL·min－1；柱流量控制模式為恒流；升溫程序（柱溫初始50℃，以2℃·min－1升溫至70℃，以10℃·min－1升至120℃，以3℃·min－1升至210℃；后運(yùn)行溫度230℃，5 min）。

MS條件：離子源為電子轟擊離子源（EI），電離電壓為70 eV，選擇全離子掃描模式，離子源溫度為230℃，四極桿溫度為150℃，接口溫度為130℃；溶劑延遲0 min。

HS條件：孵育溫度為120℃，定量環(huán)/閥溫度為130℃，傳輸線溫度為130℃，GC循環(huán)時間為55 min，孵育時間為40 min，進(jìn)樣量為1000 μL。

2.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義[13-14]。

2.4 頂空進(jìn)樣條件的考察

2.4.1 稱樣量 參考文獻(xiàn)[15-16]及儀器稱樣量限制，分別稱取樣品0.3、0.6、1 g，進(jìn)行檢測。不同稱樣量檢測出總峰面積如圖1所示。結(jié)果表明，稱樣量為1 g時，總峰面積最大。因進(jìn)樣瓶裝量限制，因此稱樣量最大為1 g。

圖1 稱樣量對峰面積影響Fig 1 Effect of sample weight on the peak area

2.4.2 頂空瓶孵育溫度 分別考察80、90、100、105、120、140、160、200℃孵育溫度對色譜峰數(shù)量與面積的影響。結(jié)果表明，孵育溫度超過120℃時，樣品顏色明顯加深，出現(xiàn)變質(zhì)現(xiàn)象，因此120℃以上的溫度不考慮。在80、90、100、105、120℃各溫度下，色譜峰數(shù)量逐漸增加，色譜圖總峰面積如圖2所示，呈增加趨勢。

圖2 孵育溫度對峰面積影響Fig 2 Effect of incubation temperature on the peak area

2.4.3 正交試驗(yàn)設(shè)計 設(shè)計三因素三水平正交試驗(yàn)。綜合考慮總峰面積、揮發(fā)油提取的溫度和單因素試驗(yàn)，擬定正交因素水平見表1，結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Tab 1 Orthogonal factor level

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Tab 2 L9(34) orthogonal test

表3 方差分析Tab 3 Analysis of variance

極差分析結(jié)果表明，RA＞RC＞RB，即孵育溫度影響最大，其次是稱樣量，孵育時間影響最小。但孵育時間對總峰面積影響不與時間成正比，在30 min時面積下降，推測其原因可能是樣品孵育時，易揮發(fā)性成分最先揮發(fā)至瓶上端使上方氣體濃度短時間升高，造成氣體混合不均，隨著時間增長，進(jìn)樣瓶中氣體混合均勻，且較難揮發(fā)性成分得以揮發(fā)使最終總峰面積增大。由方差分析可知，A因素3個水平P＝0.022＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義，B和C因素（P＞0.05）對結(jié)果沒有影響。綜合極差分析結(jié)果，選取使總峰面積最大的參數(shù)為A3B3C3，即孵育溫度為120℃，孵育時間為40 min，稱樣量為1.0 g。

3 結(jié)果與討論

經(jīng)GC-MS分析，得到醋香附揮發(fā)性成分和空白對照的GC-MS總離子流圖，見圖3及4。由圖3可知，1號峰為空白峰。色譜結(jié)果查看及質(zhì)譜解析由Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.07.00解析軟件操作完成并確定化合物[17-19]。扣除空白峰后以峰面積歸一化法測定各組分的相對百分含量。對GC-MS圖譜中的各峰進(jìn)行質(zhì)譜解析后與NIST14.L數(shù)據(jù)庫匹配確定醋香附揮發(fā)性成分，結(jié)果見表4。從醋香附中共檢出41個揮發(fā)性物質(zhì)，可以反映醋香附樣品中揮發(fā)性成分的總體特征。

圖3 醋香附揮發(fā)性成分總離子流圖Fig 3 Total ion current of volatile components in Cyperi Rhizome prepared with vinegar

圖4 空白對照的總離子流圖Fig 4 Total ion current of the blank control

表4 醋香附揮發(fā)性成分表Tab 4 Volatile components in Cyperi Rhizome prepared with vinegar

續(xù)表4

其中，相對含量＞1%的揮發(fā)性成分有醋酸、芹松香醇、環(huán)丙烯、lemnalol、脫氫芳烴、α-古巴烯、β-馬來烯、莎草烯、羅丹烯、β-蛇床烯、環(huán)氧萜烯、氧化石竹烯、8-氧代-9H-環(huán)異長葉烯、香附烯酮、α-莎草酮，占總揮發(fā)性成分的87.01%，是醋香附主要揮發(fā)性成分。2號峰醋酸的發(fā)現(xiàn)也驗(yàn)證了本樣品為香附的醋炙品。所有鑒定出的揮發(fā)性成分中氧化石竹烯、桉油精、古巴烯、莎草烯等成分在香附揮發(fā)油中也有檢出[6，8-9，20]，但總體檢出成分并不完全相同，可見提取方法與醋炙對香附的揮發(fā)性成分存在影響。HS-GC-MS法分析表明，醋香附揮發(fā)性成分中烯烴相對含量大于79.17%，含量最多，與徐黔江等[10]研究結(jié)論相符。

頂空進(jìn)樣法直接將樣品密封于樣品瓶中，經(jīng)加熱孵育可收集樣品全部揮發(fā)性成分，不必?fù)?dān)心加熱過程中低沸點(diǎn)成分的損耗；樣品經(jīng)粉碎后可直接裝樣檢測，節(jié)省時間，也不需要復(fù)雜的提取過程因此樣品基質(zhì)干擾極小；對于體積小、氣味濃烈的樣品具有無損檢測的潛力。本研究還可以為醋香附與香附的氣味對比研究和醋香附與其易混品的快速鑒別提供參考。