基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜技術的止得咳顆粒化學成分研究

黃光強，梁潔，3*，孫正伊，陳曉思，林婧，韋金玉，黃冬芳，周昱杉，趙立春，3*（.廣西中醫藥大學，南寧 53000；.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，南寧 5300；3.廣西壯瑤藥工程技術研究中心，南寧 53000）

止得咳顆粒是由黃芩、射干、薄荷、荊芥、柴胡、桔梗、枇杷葉、白前、青天葵和龍脷葉10味中藥配伍而成，長期的臨床實踐證明該方具有清熱解毒、止咳化痰之功效，尤其是在治療感冒咳嗽及支氣管哮喘等方面具有顯著療效[1]。目前，國內外對止得咳顆粒質量控制及化學成分的研究較少。在止得咳顆粒質量方面，僅僅局限于對白前、射干及黃芩中的個別成分進行分析，并未將桔梗、枇杷葉等藥味中的化學成分納入到該方的質量控制系統之中[2]。在化學成分方面，雖已有文獻對該方中單味藥的化學成分進行報道，但都未系統地對止得咳顆粒化學成分進行全面研究[3-6]。此外，由于中藥復方所含的化學成分受到藥材與制備工藝等多方面因素的影響，導致中藥復方質量參差不齊[7]。因此，本研究采用UPLCQ-Orbitrap HRMS技術對止得咳顆粒中的化學成分進行快速分析與鑒定，以明確止得咳顆粒中存在的化學成分，旨在為止得咳顆粒的藥效物質基礎研究提供依據，為其建立更加安全、有效、可控的質量控制體系提供參考和借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U3000 UPLC液相色譜儀、Q-Exactive質譜儀、TraceFinder數據分析系統（美國Thermo Fisher公司）；KQ-500DB超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；Milli-Q synergy超純水儀（美國Millipore公司）；XS205DU電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；5430R離心機（艾本德中國有限公司）。

1.2 試藥

甲醇、甲酸（色譜純，美國Fisher公司）；乙腈（色譜純，德國Merck公司）；乙酸銨（色譜純，上海斯信生物科技有限公司）。止得咳顆粒（廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，批號：20190701，規格：15 g/包）。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取止得咳顆粒樣品1.0 g，加50 mL 50%甲醇超聲提取30 min，離心后，過濾，取續濾液，進樣分析。

2.2 分析條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Thermo Hypersil Gold C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流動相為0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）（含10 mmol乙酸銨）；流速0.3 mL·min－1；梯度洗脫（0～2.0 min，5%A；2.0～42.0 min，5%～95%A；42.0～47.0 min，95%A；47～50 min，95%～5%A）；柱 溫35℃；進樣量1 μL。

2.2.2 質譜條件 離子源采用HESI源（heated ESI），正、負離子檢測模式；輔助氣體流量：10 μL·min－1；鞘氣體積流量：30 μL·min－1；噴霧電壓：3.5 kV（＋）、3.2 kV（－）；輔助氣溫度：300℃。離子傳輸管溫度：320℃。掃描方式為Full MS/dd-MS2模式，其中一級Full MS全掃描選擇分辨率為70 000 FWHM，dd-MS2的二級掃描選擇分辨率為17 500 FWHM，正、負離子掃描m/z范圍：100～1500，特定離子掃描模式為“off ”，頂點激發2～8 s，碰撞氣為高純氮，噴霧氣為氮氣。

2.3 數據處理

利用美國Thermo Fisher公司的TraceFinder數據分析軟件，擬合得到分子式和一級質譜的精確相對分子質量，將所對結果與現有數據庫進行比對，對各色譜峰進行初步推測。利用目標化合物的一級碎片離子和二級碎片離子信息與參考文獻及Chemspider、massbank等數據庫進行比對，進一步推測和鑒定未知化學成分。

3 結果

在正、負離子檢測模式下，獲得止得咳顆粒的總離子流圖（見圖1），共鑒定得到30個化學成分，包括12個黃酮及其苷類化合物，9個有機酸類化合物，3個含氮類化合物，6個其他類化合物。被鑒定化合物的相關信息見表1。

圖1 止得咳顆粒正模式（A）和負模式（B）總離子流圖Fig 1 Total ion chromatogram of Zhideke granules in both positive（A）and negative（B）modes

表1 基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜技術鑒定止得咳顆粒中的化學成分Tab 1 Chemical components in Zhideke granules identified by UPLC-Q-Orbitrap HRMS

續表1

3.1 黃酮類成分

黃酮類化合物是指兩個苯環通過三個碳原子相連形成帶有C6-C3-C6母核的一類有機化合物。羥基、甲基及甲氧基等基團在黃酮類化合物中十分常見，故其質譜裂解規律主要是失去CO、H2O、CO2及側鏈取代基[10]。以化合物7為例，由一級質譜可知其準分子離子峰為m/z359.0762 [M-H]－，分子式為C18H16O8。準分子離子峰發生裂解，同時失去三個CH3基團，得到m/z314.0060 [M-H-3CH3]－的碎片離子。隨后，m/z314.0060的碎片離子繼續發生裂解，失去一個中性CO2分子，得到m/z270.0167 [M-H-3CH3-CO2]－的碎片離子。此外，準分子離子峰也能先后失去兩個CH3碎片和一個中性CO2分子，產生m/z285.0392 [M-H-2CH3-CO2]－的碎片離子，結合文獻[13]報道的質譜信息，推測化合物7為野鳶尾黃素。

化合物12，由一級質譜可知其準分子離子峰為m/z299.0551 [M-H]－，分子式為C16H12O6。準分子離子峰發生裂解，先后失去一個CH3和一個中性CO分子，產生m/z256.0305 [M-H-CH3-CO]－的碎片離子。同時，準分子離子峰也可失去一個中性CO2分子，得到m/z255.0305 [M-H-CO2]－的碎片離子。隨后m/z255.0305的碎片離子繼續裂解，失去一個CO的中性分子，產生m/z227.0338[M-H-CO2-CO]－的碎片離子。m/z151.0029 [M-HC9H8O2]－的碎片離子是由準分子離子峰m/z299.0551發生逆狄爾斯-阿爾德（RDA）裂解反應，失去C9H8O2的碎片基團所產生的，隨后m/z151.0029的碎片離子繼續裂解，失去一個CO2的中性分子，得到m/z107.0135 [M-H-C9H8O2-CO2]－的碎片離子，由此推測化合物12為香葉木素[16]，并推測其可能的裂解路徑見圖2。

圖2 香葉木素可能的裂解路徑Fig 2 Possible fragmentation pathway of diosmetin

依據上述黃酮類成分的裂解規律，推測化合物8、9、10和11分別為鳶尾黃酮乙素、黃芩素、漢黃芩素和白楊素。

自然界中的黃酮類成分大多以苷類的形式存在，因此，糖苷鍵的斷裂是黃酮苷類成分最主要的裂解路徑，其苷元的裂解路徑則與黃酮類成分的裂解規律一致。對化合物2進行分析，由一級質譜可知其準分子離子峰為m/z461.1078[M-H]－，分子式為C21H22O11。準分子離子峰的糖苷鍵發生裂解，失去C6H10O5的碎片基團，產生m/z299.1078 [M-H-C6H10O5]－的黃酮苷元碎片離子。得到的苷元碎片離子繼續裂解，分別失去一個CH3基團和一個中性CO2分子，分別產生m/z284.0317 [M-H-C6H10O5-CH3]－和255.0293[M-H-C6H10O5-CO2]－的特征碎片離子。隨后，m/z284.0317的碎片離子繼續發生裂解，失去一個中性CO2分子，得到m/z240.0326 [M-H-C6H10O5-CH3-CO2]－的碎片離子，由此推測出化合物2為射干苷[9]，其可能的裂解路徑見圖3。

圖3 射干苷可能的裂解路徑Fig 3 Possible fragmentation pathway of tectoridin

化合物6，由一級質譜可知其準分子離子峰m/z459.0921 [M-H]－，分子式為C22H20O11。準分子離子峰糖苷鍵發生斷裂，失去一分子葡萄糖醛酸C6H8O6碎片，產生m/z283.0602 [M-H-C6H8O6]－的碎片離子。隨后，準分子離子峰繼續裂解，失去一個CH3碎片，產生m/z268.0370 [M-H-C6H8O6-CH3]－的碎片離子，結合參考文獻提供的質譜信息[12]，推測化合物6為漢黃芩苷。

根據上述黃酮苷類成分的裂解規律，推測化合物1、3、4和5分別為野黃芩苷、橙皮苷、黃芩苷和木蝴蝶苷A。

3.2 有機酸類成分

止得咳顆粒中的有機酸主要成分存在于枇杷葉、桔梗、薄荷等藥味中。按其與羧基所連的基團不同，將其分為脂肪酸和芳香酸。脂肪有機酸是指羧基與烴基相連形成的化合物，其裂解規律通常表現為先失去一分子的H2O、CO和CO2，隨后則會失去烴基等碎片離子。對化合物13進行分析，由一級質譜得其準分子離子峰為m/z191.0554[M-H]－，分子式為C7H12O6。準分子離子峰發生裂解，失去兩分子H2O和一個中性CO分子，產生m/z127.0398 [M-H-2H2O-CO]－的碎片離子。此外，準分子離子峰也可失去三分子H2O和一個中性CO2分子，產生m/z93.0343 [M-H-3H2O-CO2]－的碎片離子，由此推測化合物13為右旋奎寧酸[17]。

化合物14，由一級質譜信息得其準分子離子峰為m/z191.019 [M-H]－，分子式為C6H8O7。準分子離子峰發生裂解，失去一分子H2O，產生m/z173.0085 [M-H-H2O]－的碎片離子，得到的此碎片離子繼續裂解，失去一分子H2O和一個中性CO2分子，產生m/z111.0084 [M-H-2H2O-CO2]－的碎片離子。同時，m/z173.0085的碎片離子也可直接失去一個中性CO2分子，得到m/z129.0189[M-H-H2O-CO2]－的碎片離子。此外，準分子離子峰也可先后失去一個中性CO2分子，產生m/z102.9488 [M-H-2CO2]－的碎片離子，由此推測化合物14為檸檬酸[17]。

化合物21，由一級質譜得其準分子離子峰為m/z187.0969 [M-H]－，分子式為C9H16O4。準分子離子峰發生裂解，失去一個中性CO2分子，產生m/z143.1070 [M-H-CO2]－的碎片離子，得到的碎片離子繼續裂解，失去一分子H2O，產生m/z125.0967 [M-H-CO2-H2O]－的碎片離子，然后繼續裂解，分別失去C2H4和C4H8的碎片，產生m/z97.0654 [M-H-CO2-H2O-C2H4]－和m/z69.0342[M-H-CO2-H2O-C4H8]－的碎片離子，推測化合物21為壬二酸[17]，并推測其可能的裂解路徑見圖4。

圖4 壬二酸可能的裂解路徑Fig 4 Possible fragmentation pathway of azelaic acid

芳香酸一般是指分子結構中同時含有苯環和羧基的一類化合物。這類化合物在發生質譜裂解時易失去芳香側鏈基團，隨后失去CO2、H2O和CO等中性分子。對化合物16進行分析，由一級質譜可知其準分子離子峰為m/z197.0448[M-H]－，分子式為C9H10O5。準分子離子發生裂解，失去一分子H2O，產生m/z179.0343 [M-HH2O]－的碎片離子，得到的碎片離子繼續裂解，分別失去一個中性CO分子和一個中性CO2分子，同時產生m/z151.0399 [M-H-H2O-CO]－和m/z135.0369 [M-H-H2O-CO2]－的特征碎片離子。此外，準分子離子峰中的芐基碳也能發生裂解，失去C7H8O2的碎片基團，產生72.9928 [M-HC7H8O2]－的碎片離子，由此推測化合物16為丹參素[18]，并推測其可能的裂解路徑見圖5。

圖5 丹參素可能的裂解路徑Fig 5 Possible fragmentation pathway of danshensu

化合物17，由一級質譜信息可知其準分子離子峰為m/z353.0867 [M-H]－，分子式為C16H18O9。準分子離子發生裂解，分別失去C7H10O5和C9H6O3的碎片基團，產生m/z179.0343 [M-H-C7H10O5]－和m/z191.0554 [M-H-C9H6O3]－的碎片離子，隨后m/z191.0554 [M-H-C9H6O3]－的碎片離子繼續裂解，脫去一分子H2O，產生m/z173.0448 [M-H-C9H6O3-H2O]－的碎片離子，由此推測化合物17為隱綠原酸[17]，其可能的裂解路徑見圖6。

圖6 隱綠原酸可能的裂解路徑Fig 6 Possible fragmentation pathway of cryptochlorogenic acid

化合物20，由一級質譜信息可知其準分子離子峰為m/z537.1027 [M-H]－，分子式為C27H22O12。m/z493.1027 [M-H-CO2]－的碎片離子是由準分子離子峰失去一個CO2分子所產生的，隨后，其繼續裂解，分別失去C9H10O5和C9H8O4的碎片離子，產生m/z295.0601 [M-H-CO2-C9H10O5]－和m/z313.0710 [M-HC9H8O4]－的碎片離子，得到的m/z295.0601碎片離子繼續裂解，失去C11H6O3的碎片基團，產生m/z109.0291[M-H-CO2-C9H10O5-C11H6O3]－的碎片離子，由此推測化合物20為紫草酸[20]。

依據上述芳香酸的裂解規律，推測化合物15、18和19分別為沒食子酸、咖啡酸和對羥基肉桂酸。

3.3 含氮類成分

含氮類化合物主要是指分子結構中含有氮元素的一類有機化合物，主要包括核苷、氨基酸和煙酰胺等。止得咳顆粒中的含氮類化合物主要來源于薄荷、柴胡等藥味。含氮化合物質譜裂解規律主要表現為失去H2O、CO2、NH3、COOH及OH等碎片基團。同時，核苷類化合物之間的核苷鍵易發生斷裂。對化合物22進行分析，由一級質譜得到其準分子離子峰為m/z182.0803 [M＋H]＋，分子式為C9H11NO3。準分子離子峰發生裂解，失去一個COOH碎片基團，產生m/z136.0751 [M＋H-HCOOH]＋的碎片離子，該碎片離子繼續裂解，失去一個CH3碎片，得到m/z119.0488 [M＋H-COOH-NH3]＋的碎片離子。此外，準分子離子峰也可能發生另一種路徑的裂解，同時失去一個OH基團和一個NH3分子，產生m/z147.0434 [M＋H-H2O-NH3]＋的碎片離子。m/z147.0434的碎片離子失去C2H3O2的碎片離子得到m/z91.0543 [M＋H-OH-NH3-C2H3O2]＋的碎片離子，由此推測化合物22為L-酪氨酸[10]，其可能的質譜裂解路徑見圖7。

圖7 L-酪氨酸可能的裂解路徑Fig 7 Possible fragmentation pathway of L-tyrosine

化合物23，在負離子模式下得到的準分子離子峰為m/z243.0615 [M-H]－，分子式為C9H12N2O6。準分子離子峰發生裂解，分別失去C5H8O4和C5H9O4碎片基團，同時得到m/z111.0198 [M-H-C5H8O4]－和m/z110.0245 [M-H-C4H7NO4]－的碎片離子。隨后，m/z110.0245的碎片離子繼續裂解，失去一個中性CO分子，產生m/z82.0296 [M-H-C5H9O4-CO]－的碎片離子，由此推測化合物23為尿苷[21]，其可能的裂解路徑見圖8。

圖8 尿苷可能的裂解路徑Fig 8 Possible fragmentation pathway of uridine

化合物24，由一級質譜得到其準分子離子峰為m/z123.0548 [M＋H]＋，分子式為C6H6N2O。準分子離子峰發生裂解，失去一個中性CO分子，產生m/z95.0606 [M＋H-CO]＋的碎片離子。此外，準分子離子峰也可先后失去一個NH3分子和一個中性CO分子，得到m/z78.0341 [M＋H-NH3-CO]＋的碎片離子。同時，苯環與羰基所連的C-C鍵和吡啶環也可發生裂解，分別失去CHN和CONH碎片基團，分別得到m/z96.0444 [M＋H-CHN]＋和m/z80.0497 [M＋H-CONH]＋的碎片離子，由此推測化合物24為煙酰胺[22]。

3.4 其他類成分

止得咳顆粒中除了上述的化學成分之外，還存在一些其他類化合物，包括糖類、酚類及少量的揮發性成分等。對化合物25進行分析，由一級質譜得到其準分子離子峰為m/z181.0711 [M-H]－，分子式為C6H14O6。分子離子峰發生裂解，失去一分子H2O，產生m/z163.0670 [M-H-H2O]－的碎片離子，此碎片離子繼續裂解，分別失去C2H6O2、C4H8O3和C3H6O2的碎片基團，得到m/z101.0240 [M-HH2O-C2H6O2]－、m/z59.0136 [M-H-H2O-C4H8O3]－和m/z89.0241 [M-H-H2O-C3H6O2]－的碎片離子。隨后，m/z89.0241的碎片離子繼續裂解，失去一分子H2O，產生m/z71.0135 [M-H-2H2O-C3H6O2]－的碎片離子，由此推測化合物25為甘露醇[23]，其可能的質譜裂解路徑見圖9。

圖9 甘露醇可能的裂解路徑Fig 9 Possible fragmentation pathways of mannitol

化合物26，由一級質譜得到其準分子離子峰為m/z341.1078 [M-H]－，分子式為C12H22O11。準分子離子峰發生裂解，失去C9H16O8的碎片基團，產生m/z89.0241 [M-H-C9H16O8]－的碎片離子；隨后，此碎片離子離子繼續裂解，失去一分子H2O，產生m/z71.0136 [M-H-C9H16O8-H2O]－的碎片離子，這與文獻[24]報道的質譜數據信息基本相同，由此推測化合物26為蔗糖。同理，并結合文獻[25]，推測化合物27為棉籽糖。

化合物28，在正離子模式下的準分子離子峰為m/z127.0384 [M＋H]＋，分子式為C6H6O3。準分子離子m/z發生裂解后，先后失去一個H2O和一個中性CO分子，產生m/z81.0337 [M＋H-H2OCO]＋的碎片離子，此碎片離子繼續裂解，失掉一個中性CO分子，產生m/z53.0392 [M＋H-H2O-2CO]＋的碎片離子。此外，準分子離子也能失去兩個CO中性分子，得到m/z71.0495 [M＋H-COCO]＋的碎片離子，由此推測化合物28為5-羥甲基糠醛[26]。

化合物29，由一級質譜信息得到其準分子離子峰為m/z137.0238 [M-H]－，分子式為C7H6O3。準分子離子峰發生裂解，分別失去一個中性CO分子、一個中性CO2分子和一個CHO碎片基團，同時生成m/z109.0213 [M-H-CO]－、m/z93.0342[M-H-CO2]－和108.0213 [M-H-CHO]－的碎片離子。隨后，得到的m/z109.0213碎片離子繼續裂解，失去一個中性CO分子，產生m/z81.0343[M-H-2CO]－的碎片離子，結合參考文獻[27]的質譜信息，推測化合物29為原兒茶醛。

化合物30，由一級質譜可知其準分子離子峰為m/z623.1966 [M-H]－，分子式為C29H36O15。準分子離子峰發生裂解，失去咖啡酰基C9H6O3，產生m/z461.1658 [M-H-C9H6O3]－的碎片離子。同時，準分子離子也可失去C20H28O11碎片基團，產生m/z179.0343 [M-H-C20H28O11]－的碎片離子；隨后此碎片離子繼續裂解，失去一個H2O分子，產生m/z161.0238 [M-H-C20H28O11-H2O]－的碎片離子，結合參考文獻[28]的質譜碎片信息，推測化合物30為異麥角甾苷。

4 討論

本研究利用UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術對止得咳顆粒中的化學成分進行了分析，共鑒定出30個化學成分，結果表明其含有的主要成分為黃酮類及其有機酸類化合物。黃酮類成分具有抗菌、抗病毒、抗炎、解熱及鎮咳的藥理活性[29]，有機酸類成分大多具有止咳平喘及抗炎、抗菌和抗病毒的作用[30-31]。這與止得咳顆粒在臨床上用于感冒咳嗽、止咳化痰的作用基本一致，為該方在臨床上更好地應用提供了科學依據。但有關龍脷葉、青天葵等壯藥的研究較少，其中的許多化學成分都不明確，故無法對某些鑒定出的化學成分的來源進行歸屬。加之，由于現有數據庫及文獻資料的限制，僅從質譜的角度對化合物結構進行鑒定仍然存在一定的困難。因此，后續研究過程還需要進一步通過與對照物比對，并結合制備液相及大孔吸附樹脂等方法對止得咳顆粒中的化學成分進行分離純化，并連同氫譜、碳譜及IR光譜等方法對分離得到的化合物的結構進行確認，以明確止得咳顆粒中的化學物質基礎，為該方進一步的質量控制及藥效物質基礎研究提供參考與借鑒。